Изолирование митохондрий летательной мускулатуры шмелей Bombus terrestris L
  1. МЮ Сыромятников #
    syromyatnikov at bio dot vsu dot ru
    Воронежский государственный университет, Воронеж 394006, Университетская пл
  2. МЮ Чугреев
    Воронежский государственный университет, Воронеж 394006, Университетская пл
  3. АВ Лопатин
    Воронежский государственный университет, Воронеж 394006, Университетская пл
  4. АА Старков
    ans2024 at med dot cornell dot edu
    Weill Medical College Cornell University, New York, 525 E 68th street, A501, NY 10065, USA
  5. ВН Попов
    Воронежский государственный университет, Воронеж 394006, Университетская пл
# : соответствующие автор
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/rs.ru.1.750
Дата
2014-05-03
Цитировать как
Research ru 2014;1:750
лицензия
Абстракт

Описан метод изолирования хорошо сопряженных митохондрий летательных мышц шмелей Bombus terrestris L. и состав среды инкубации для измерения параметров дыхания митохондрий. Метод изолирования основан на выделении митохондрий из гомогената грудных мышц шмелей посредством 3х ступенчатого дифференциального центрифугирофания. Для получения хорошо сопряженных митохондрий среда инкубации не должна содержать высоких концентраций хлорида калия. Максимальные скорости дыхания наблюдались при окислении α-глицерофосфата, при этом, наибольший коэффициент дыхательного контроля наблюдается при окислении пирувата. Скорости дыхания при окислении сукцината, малата, глутамата, их комбинации и пролина незначительны.

English Abstract

The study describes a method for isolating well-coupled mitochondria from flying muscles of bumblebee Bombus terrestris L. and composition of the incubation medium for measuring the parameters of mitochondrial respiration. The isolation method is based on isolation of mitochondria from homogenate of bumblebee pectoral muscles by 3-step differential centrifugation. For isolation of well-coupled mitochondria, incubation medium must not contain high concentration of potassium chloride. The maximum respiration rate was observed for the oxidation of α- glycerophosphate, wherein the highest respiratory control coefficient was detected in the oxidation of pyruvate. Respiration rates in the oxidation of succinate, malate, glutamate, proline and their combinations are insignificant.

Цель работы

Большая часть исследований биохимии основных коммерчески важных опылителей (пчел и шмелей) была выполнена в 1960–1970-е гг. и носила выборочный и ограниченный характер. Для шмелей вообще отсутствуют какие-либо данные о свойствах митохондрий их летательных мышц. Между тем, уникальность шмелей как опылителей состоит в их способности к «баззингу» (от англ. «buzzing»), сильному сотрясению цветков за счет интенсивных вибраций мышц крыльев. Эта активность требует значительного расхода энергии ATP, синтезируемого в процессе окислительного фосфорилирования в митохондриях. Поэтому, биохимия митохондрий их летательной мускулатуры представляет особый практический интерес, например, для установления токсичности пестицидов. До настоящего времени исследования митохондрий шмелей значительно ограничивало отсуствие стандартного метода их изоляции, который бы позволял получать органеллы с достаточно хорошими дыхательными характеристиками. В данной публикации мы описываем удобный и простой метод выделения митохондрий летательных мышц шмелей с использованием стандартного, коммерчески доступного оборудования и приводим первичную оценку их биоэнергетических параметров.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
  • А. Изолирование митохондрий летательных мышц шмеля.
    • 1. Объект исследования. Используются самцы шмелей B. terrestris L., приобретенные у коммерческого производителя (ООО Бамблби Компани, г. Воронеж) в возрасте 10–15 дней после их выплода из куколок.
    • 2. Оборудование.
      • 2.1. Морозильная камера.
      • 2.2. Мелкодробленый лед или снег для ледяной бани.
      • 2.3. Лабораторная охлаждаемая центрифуга (использовали Hermle Z36HK, ротор C0036-22) с центрифужными пробирками объемом по 40 мл.
      • 2.4. Стеклянный гомогенизатор типа Dounce (стеклянный стакан–стеклянный пестик, использовали «Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle», USA) с неплотно прилегающим пестиком («loose pestle A», величина зазора пестик-стакан порядка 0,1–0,17 мм).
      • 2.5. Марля
      • 2.6. Мелкое лабораторное оборудование – острые небольшие ножницы для диссекции шмелей, лабораторные стеклянные стаканы, пипетки-дозаторы.
    • 3. Растворы и реагенты (все реактивы приобретались в фирме «Sigma» (USA), если не указано дополнительно). Все водные растворы приготавливаются на воде высокой очистки (использовали воду, деионизированную с помощью Simlicity® system)
      • 3.1. Среда выделения митохондрий содержит 220 мМ маннитол, 100 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 2 мг/мл свободного от жирных кислот БСА, 20 мМ HEPES pH 7,3; Приготовленная среда может храниться несколько дней при температуре +4°С в условиях стерильности, или замораживаться для более дллительного хранения. В последнем случае рекомендуется проверить рН среды после оттаивания.
      • 3.2. Среда промывания митохондрий содержит 220 мМ маннитол, 100 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 20 мМ HEPES pH 7,3; рекомедации по приготовлению и хранению см выше.
  • Б. Методы и реагенты, использовавшиеся для тестирования качества и биоэнергетических характеристик изолированных митохондрий.

    Содержание митохондриального белка определяли спектрофотометрически с помощью коммерческого набора «BCA assay» («Pierce Biotechnology» «Thermo Scientific», США).

    Дыхание митохондрий. Скорость поглощения кислорода митохондриями регистрировали при помощи оксиметра («Hansatech Instruments», США). Все измерения проводили при 24 °С в 1 мл среды инкубации, содержащей 220 мМ маннитол, 100 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 4 мМ фосфат калия, 20 мМ HEPES pH 7,3, и субстраты дыхания (указаны в тексте). Митохондрии (100–200 мкг белка) добавляли в среду регистрации дыхания с последующей добавкой субстратов дыхания, АДФ (200 мкМ), и карбоксиатрактилата (ингибитор АДФ/АТФ антипортера, 1 мкМ). Индекс дыхательного контроля рассчитывали как отношение скорости дыхания (в присутствии АДФ) к скорости нефосфорилирующего дыхания после добавки карбоксиатрактилата. Все измерения выполняли в течение 1,5 ч после выделения митохондрий.

    Оценка целостности внутренней мембраны митохондрий. Целостность внутренней мембраны митохондрий оценивали посредством измерения активности митохондриальной малатдегидрогеназы. В 2 мл среды выделения митохондрий добавляли 50 мкг свежевыделенных митохондрий и 2 мкМ ротенона, инкубировали 5 мин. Затем добавляли 200 мкМ NADH и 400 мкМ оксалоацетата. Измеряли скорость падения оптической плотности при 340 нм. Процедуру повторяли в присутствии 0,01%-ного детергента нонидет. Предварительные эксперименты показали, что такая концентрация детергента достаточна для полного разрушения внутренней мембраны митохондрий.

ХОД РАБОТ.
  • 4.0. Для выделения митохондрий используется 9--10 самцов B. terrestris.
  • 4.1. Живых шмелей охлаждают при –20° С в течение 15 мин (Рис. 1 А).
  • 4.2. Грудки отделяют от головы и брюшка ножницами (Рис. 1Б), и помещают в охлажденный до ~0-4°С раствор 12–15 мл среды выделения, находящийся в ледяной бане.
  • 4.3. Грудки измельчаются ножницами, суспензия измельченной ткани переносится в охлажденный до ~0-4°C стакан гомогенизатора, находящийся в ледяной бане.
  • 4.4. Ткань гомогенизируется вручную в течение 2 мин, 3–5 ходов пестика.
  • 4.5. Полученный гомогенат фильтруется через 4 слоя марли и помещается в центрифужный стакан; объем гомогената доводится средой выделения до 35 мл.
  • 4.6. Центрифужный стакан помешается в охлажденный до -4о ротор центрифуги и центрифугируется 5 мин при 600 g.
  • 4.7. Супернатант аккуратно отбирается в чистый центрифужный стакан так, чтобы не затронуть осадок, и центрифугируется 10 мин при 10 000 g.
  • 4.7. Полученный супернатант отбрасывается, а осадок тщательно (используя 1 мл пипетку-дозатор) ресуспендируется в 1 мл охлажденного до ~0°-4° С раствора среды промывания.
  • 4.8. Полученная суспензия митохондрий разводится до 35 мл охлажденной до ~0°-4о средой промывания и центрифугируется 10 мин при 10 000 g.
  • 4.9. Супернатант отбрасывается, содержащий митохондрии осадок ресуспендируется в 100–120 мкл охлажденной до ~0°-4° С среды промывания и хранится на льду в течение эксперимента.
РЕЗУЛЬТАТЫ

Процедура выделения митохондрий. Наши попытки использовать «классическую» процедуру выделения митохондрий из летательных мышц насекомых [1] не увенчались успехом. Причины этого неясны; скорее всего, значительная толщина хитиновой оболочки шмелей требует для ее разрушения большее механическое усилие, чем для мелких насекомых, что может приводить к разрушению митохондрий летательных мышц шмелей. Нужно отметить, что практически во всех опубликованных работах с изолированными митохондриями млекопитающих и насекомых в качестве критерия качества препарата служит коэффициент дыхательного контроля для NAD+-зависимых субстратов окисления. Между тем, в отсутствие информации об особенностях окисления используемых субстратов, интерпретация значений дыхательного контроля затруднена и не обязательно отражает степень интактности препарата митохондрий. В связи с этим, мы использовали энзиматический метод оценки проницаемости внутренней мембраны митохондрий. Примененный нами метод основан на надежно установленном факте (для большинства исследованных организмов) непроницаемости внутренней мембраны митохондрий для NADH и оксалоацетата. Фермент матрикса митохондрий малатдегидрогеназа катализирует окисление NADH оксалоацетатом; в препарате изолированных митохондрий окисление экзогенного NADH оксалоацетатом возможно только в случае достаточно серьезных повреждений внутренней мембраны органелл. В дальнейших опытах мы использовали только те митохондрии, для которых степень стимуляции малатдегидрогеназной активности детергентом была не менее 7 раз.

Субстрат окисления Фосфорилирующее дыхание Нефосфорилирующее дыхание Коэффициент дыхательного контроля
(+ADP) (+кАтр)
Сукцинат 54 ±1,72 49,1 ±4,35 1,1
α-Глицерофосфат 202,7±12,4 135,1 ±17,6 1,5
Таблица 1.. Скорость поглощения кислорода и величина дыхательного контроля изолированных митохондрий B. terrestris, окисляющих FAD-зависимые субстраты. Примечание. Состав среды инкубации указан в разделе «Методы исследования»; концентрация каждого из субстратов 10 мМ. АДФ добавляли в концентрации 200 мкМ; кАтр – 1 мкМ. Показаны средние значения и ошибка среднего.

Оптимизация среды инкубации и окислительных субстратов для получения высоких дыхательных характеристик митохондрий летательной мускулатуры шмелей.

Эффективность окисления экзогенных интермедиатов цикла трикарбоновых кислот митохондриями млекопитающих в значительной степени обусловлена наличием и активностью белков-переносчиков этих веществ во внутренней мембране митохондрий, кодируемых 46 известными генами семейства SLC25 [2] [3]. Наиболее часто используемыми комбинациями субстратов в исследованиях митохондрий млекопитающих являются комбинации пирувата или глутамата с малатом, и сукцинат. В то же время, наличие таких переносчиков, по-видимому, не является необходимым для обеспечения высокой активности окислительного фосфорилирования в митохондриях летательных мышц насекомых. Считается, что митохондрии летательных мышц насекомых не способны окислять малат, глутамат, и сукцинат в силу отсутствия необходимых переносчиков [1] [4]. Тем не менее, приложение a priori таких выводов к митохондриям шмелей не представляется оправданным ввиду значительных различий в биохимии различных таксономических групп летающих насекомых. В связи с этим, было интересно выяснить эффективность окисления различных NAD+- и FAD-зависимых субстратов митохондриями шмелей.

Изолирование митохондрий летательной мускулатуры шмелей Bombus terrestris L Рисунок 1
Рисунок 1. Подготовка препаратов B.Terrestris для выделения митохондрий. А. B.Terrestris после охлаждения при –20° С в течение 15 мин. Б. Диссекция грудок B.Terrestris для изолирования митохондрий из летатeльных мышц.

В качестве среды инкубации мы опробовали два широко используемых состава: с низкой ионной силой («сахарозная среда» состоящая из 220 мМ маннитола, 100 мМ сахарозы, 1 мМ ЭГТА, 4 мМ фосфата калия, 20 мМ HEPES pH 7,3) и с высокой ионной силой («калиевая среда», состоящая из 150 мM КCl, 20 мM HEPES pH 7,4, 0,2 мг/мл БСА, очищенного от жирных кислот, 1 мМ ЭГТА). Скорость дыхания и степень сопряжения препаратов были значительно ниже при использовании калиевой среды, поэтому все результаты были получены с использованием сахарозной среды.

Окисление субстратов оценивали, регистрируя максимальные скорости фосфорилирующего дыхания. Проводили учет как максимальных скоростей фосфорилирующего дыхания, так и величины дыхательного контроля изолированных митохондрий (Рисунок 2А, Б). Оказалось, что митохондрии шмелей почти не способны окислять экзогенные малат, глутамат, цитрат и пролин. В то же время окисление экзогенного пирувата было весьма эффективно, при этом добавление малата, пролина или глутамата значительно увеличивало скорость фосфорилирующего дыхания. Максимальная величина дыхательного контроля наблюдалась при использовании пирувата при отсутствии других добавок; при окислении пирувата в комбинации с малатом, глутаматом и пролином также наблюдался достаточно высокий дыхательный контроль. Окисление пролина представляет особый случай, так как пролин окисляется в митохондриях в две стадии, первая – скорость-лимитирующая – является FAD-зависимой, с убихиноном дыхательной цепи в качестве финального акцептора электронов, тогда как вторая стадия NAD+-зависимая [5]. Принято считать, что эффективное окисление пролина характерно для митохондрий летательных мышц кровососущих насекомых [6] и является адаптацией к специфическому, богатому пролином, виду основной пищи этих насекомых. Однако пыльца растений, также достаточно богатая пролином [7], составляет значительную часть питания шмелей. Тем не менее, окисление пролина митохондриями шмелей происходит медленно и с низким коэффициентом дыхательного контроля (рис. 2Б).

Изолирование митохондрий летательной мускулатуры шмелей Bombus terrestris L Рисунок 2
Рисунок 2. Влияние субстратов окисления на скорость фосфорилирущего дыхания митохондрий летательных мышц B.Terrestris. А, скорость поглощения кислорода. Б. Индекс дыхательного контроля. Сокращения: пир, пируват; мал, малат; глут, глутамат; цитр, цитрат; прол, пролин. Все субстраты добавлялись в концентрациии 10 мМ.
ВЫВОДЫ
  • 1. Описан простой и стандартизированный метод выделения митохондрий летательных мышц шмелей, позволяющий получать хорошо сопряженный препарат;
  • 2. Оптимизированы условия для биоэнергетической оценки препарата митохондрий шмелей посредством регистрации скорости поглощения кислорода;
  • 3. Приведена первичная характеристика окислительной активности митохондрий шмеля. Хотя представленные в работе данные о дыхании митохондрий носят ограниченный характер, они позволяют утверждать, что свойства митохондрий шмелей сходны с описанными ранее для большинства летающих насекомых [1] [8], и особенно близки к представителям отряда Diptera: мясная (Blowfly, Phormia regina) и домашняя мухи (Housefly, Musca domestica). Более подробно результаты данных исследований описаны в публикации в журнале «Биохимия» (Syromyatnikov MY, Lopatin AV, Starkov AA, Popov VN. Isolation and properties of flight muscle mitochondria of the bumblebee Bombus terrestris (L.). Biochemistry (Mosc). 2013 Aug;78(8):909-14. doi: 10.1134/S0006297913080075. PMID: 24228879)
    Заявления
    Принятые сокращения

    АДФ – аденозин-5'-дифосфат; АТФ – аденозин-5'-трифосфат; KCl – хлорид калия; KCN – цианид калия; NAD – β-никотинамидадениндинуклеоти́д; NADH – восстановленный β-никотинамидадениндинуклеоти́д; FAD – флавинадениндинуклеоти́д; HEPES – 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота; БСА – бычий сывороточный альбумин, очищенный от жирных кислот; 2,4-ДНФ – 2,4 динитрофенол; ДХФИФ – 2,6–дихлорфенолиндофенол; кАтр – карбоксиатратилат; СДГ – сукцинатдегидрогеназа; ЭГТА – этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N′,N′-тетрауксусная кислота; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; остальные использованные сокращения разъяснены в тексте и в подписях к рисункам.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Работа проводилась в рамках проектов финансируемых Министерства Образования и Науки Российкой Федерации ВГУ № 1035 N 14.B37.21.1229, и РФФИ (грант 14-04-31618 мол_а).

Ссылки
  1. Bergh, S.G.V.d. (1967) Methods in Enzymology, 10, 117–122.
  2. Palmieri F. The mitochondrial transporter family (SLC25): physiological and pathological implications. Pflugers Arch. 2004;447:689-709 pubmed
  3. Haitina T, Lindblom J, Renström T, Fredriksson R. Fourteen novel human members of mitochondrial solute carrier family 25 (SLC25) widely expressed in the central nervous system. Genomics. 2006;88:779-90 pubmed
  4. van den Bergh S, Slater E. The respiratory activity and permeability of housefly sarcosomes. Biochem J. 1962;82:362-71 pubmed
  5. Servet C, Ghelis T, Richard L, Zilberstein A, Savoure A. Proline dehydrogenase: a key enzyme in controlling cellular homeostasis. Front Biosci (Landmark Ed). 2012;17:607-20 pubmed
  6. Bursell E. Substrates of oxidative metabolism in dipteran flight muscle. Comp Biochem Physiol B. 1975;52:235-8 pubmed
  7. Lehmann S, Funck D, Szabados L, Rentsch D. Proline metabolism and transport in plant development. Amino Acids. 2010;39:949-62 pubmed publisher
  8. Sacktor B. Biochemical adaptations for flight in the insect. Biochem Soc Symp. 1976;:111-31 pubmed
ISSN : 2334-1009