ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШЕСТИ ВИДОВ ЛИСТЕРИЙ МЕТОДОМ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИН РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ПЦР-АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ВНУТРЕННИХ ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРОВ ГЕНОВ 16S-23S РИБОСОМНОЙ РНК
ДМ Пачкунов1, ЕИ Асташкин1, НН Карцев1, ВН Борзенков1, ОИ Тазина1, ЮН Ковалев1, НР Ефимочкина2, ИП Мицевич1, ЭА Светоч1, ИА Дятлов1, НК Фурсова1 (n-fursova at yandex dot ru) #
1 ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, 142279, Оболенск. 2 ФГБУ Научно-исследовательский институт питания РАМН, 109240, Москва, Российская Федерация
# : соответствующие автор
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/rs.ru.1.867
Дата
2014-06-07
Цитировать как
Research ru 2014;1:867
лицензия
Абстракт

Разработан алгоритм видовой идентификации бактерий рода Listeria, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ПЦР-амплифицированного внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-локуса), локализованного между генами 16S и 23S рРНК. Алгоритм включает в себя наработку ПЦР-продуктов с помощью специфичных праймеров G1 и L1, опубликованных Drebot et al. (1996), гидролиз эндонуклеазами рестрикции BseMII, ScaI и TasI и определение длин рестрикционных фрагментов с помощью электрофореза в агарозном геле. Алгоритм позволяет на первом этапе дифференцировать листерии патогенного для человека вида Listeria monocytogenes, на втором – листерии вида Listeria innocua, а на третьем – идентифицировать остальные четыре вида листерий - патогенный для животных Listeria ivanovii и непатогенные Listeria seeligeri, Listeria welshimeri и Listeria grayi. Данный подход апробирован на 66 штаммах листерий из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск», из рабочих коллекций отдела молекулярной микробиологии ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии и лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома НИИ питания РАМН.

English Abstract

An algorithm for the identification of Listeria species based on the restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the PCR-amplified internal transcribed spacer (ITS-locus) located between 16S and 23S rRNA genes has been designed. This method includes accumulation of the PCR-products using G1 and L1 specific primers designed by Drebot et al. (1996); hydrolysis by BseMII, ScaI, and TasI restriction endonucleases; and determining the restriction fragments lengths by agarose gel electrophoresis. An algorithm allows differentiating the human pathogen Listeria monocytogenes on the first stage, nonpathogenic Listeria innocua – on the second stage and remaining four listeria species (animal pathogen Listeria ivanovii and nonpathogenic Listeria seeligeri, Listeria welshimeri and Listeria grayi) – on the third stage. The approach has been tested using 66 listeria strains from the State Collection of Pathogenic Microorganisms «SCPM-Obolensk» and working collections of the Molecular Microbiology Dep. of the State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology and the Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis Lab. of the Research Institute of Nutrition of the Russian Academy of Medical Sciences.

Грамположительные факультативно-анаэробные бактерии рода Listeria включают в себя шесть часто выделяемых видов L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi, а также редко идентифицируемые виды L. marthii, L. rocourtiae, L. weihenstephanensis и L. fleischmannii [1] [2] [3] [4] [5]. Вид L. monocytogenes патогенен для человека и жвачных животных, является этиологическим агентом листериоза, который может протекать в инвазивной форме с поражением репродуктивной системы (аборты) [6], центральной нервной системы (менингиты, менингоэнцефалиты) и бактериемией с высоким уровнем смертности 20-30% [7] или в неинвазивной форме в виде гастроэнтерита [8]. Вид L. ivanovii до недавнего времени считался патогенным только для жвачных животных, однако в 2010 г. описан случай инфекции, вызванной возбудителем данного вида, у человека с трансплантированной почкой [9]. Кроме того, редкие случаи инфицирования человека описаны для L. grayi, L. seeligeri и L. innocua [10] [11] [12]. Листерии достаточно широко распространены в окружающей среде, способны выживать в стрессовых условиях и длительно сохраняться во многих пищевых продуктах, в том числе растительного происхождения [13] [14]. Непатогенные листерии рассматриваются как резервуар детерминант резистентности и потенциального изменения фитнеса, которые могут быть переданы патогенным листериям путем горизонтального переноса [15]. Поэтому видовая идентификация представителей рода Listeria, выделяемых от больных людей и животных, а также из пищевых продуктов и окружающей среды, представляет большой практический и теоретический интерес.

Для идентификации и выяснения таксономического положения различных бактерий многими исследователями широко используется изучение их рибосомных рибонуклеиновых кислот (рРНК) и генов, кодирующих рРНК, [16] [17] [18], в том числе – представителей рода Listeria [19] [20] [21]. Последовательности генов рРНК у листерий достаточно консервативны, что не позволяет использовать их для дифференциации данных видов. Менее консервативными являются последовательности межгенных регионов, в том числе - внутренний транскрибируемый спейсер (ITS-локус), расположенный между генами 16S и 23S рРНК [22] [23] [24]. Анализ нуклеотидных последовательностей ITS-локуса генов 16S и 23S рРНК in situ показал, что они отличаются у наиболее распространенных шести видов листерий, а также у разных серотипов L. monocytogenes [25].

Цель данной работы - разработка алгоритма идентификации видов листерий на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных ITS-локусов, расположенных между генами 16S и 23S рРНК (ПЦР-ПДРФ); апробация алгоритма на референс-штаммах листерий и использование разработанного подхода для видовой идентификации штаммов Listeria spp., выделенных из пищевых продуктов и окружающей среды в 2008-2013 гг.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы микроорганизмов

В работе использованы 66 штаммов листерий из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» и рабочих коллекций отдела молекулярной микробиологии ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии и лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома НИИ питания РАМН: L. monocytogenes (n = 33), L. innocua (n = 19), L. seeligeri (n = 2), L. welshimeri (n = 4), L. ivanovii (n = 3) и L. grayi (n = 5) (табл. 1). Видовая идентификация бактерий подтверждена методом масс-спектромерии на приборе MALDI-TOF Biotyper (Bruker, Германия). Хранение культур осуществляли в лиофильно высушенном виде, а также в 20 %-ном глицерине при температуре минус 80 °С.

Выращивание микроорганизмов

Культивирование листерий проводили на агаризованных селективно–диагностических питательных средах: РАLCAM agar (НiMedia, Индия), Oxford agar (Oxoid, Великобритания), ПАЛ агар (Оболенск, Россия). Для дальнейшей характеристики и идентификации культуры пересевали на мясо-пептонный агар (МПА) с 1 % глюкозы (Оболенск, Россия), триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) (НiMedia, Индия), триптиказо-соевый агар (TSА) (НiMedia,Индия), мясо-пептонный бульон (МПБ) с 1 % глюкозы (Оболенск, Россия), триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEВ) (НiMedia, Индия), триптиказо-соевый бульон (TSВ) (НiMedia, Индия). Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Исследование культуральных свойств листериозных штаммов проводили согласно методам, представленным в ГОСТ Р 51921-2002 (Продукты пищевые Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes ) и в Методических указаниях (МУК 4.2.1122-02 Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах). Для подтверждения принадлежности культур к бактериям рода Listeria проверяли их окраску по Граму, отсутствие у бактерий капсул и спор, подвижность при 22 °С и 37 °С.

Изучение биохимических и ферментативных свойств осуществляли путем определения способности бактерий ферментировать углеводы (маннит, ксилозу, маннозу и рамнозу) на средах Гисса; образовывать зоны просветления при посеве на поверхность кровяного агара (β-гемолитическая активность); проявлять лецитиназную активность на средах с активированным углем и без угля, каталазную и нитратредуцирующую активность, а также с помощью КАМП-теста (Camp–test).

Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли по минимальным подавляющим концентрациям (МПК) методом микроразведений в бульоне, в соответствии с требованиями, изложенными в Методических указаниях МУК4.2. 1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Амплификация ДНК

В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали термоинактивированные клеточные лизаты, которые готовили как описано ранее [26]. Амплификацию ДНК с помощью олигонуклеотидных праймеров G1 (5’ GAAGTCGTAACAAGG 3’), специфичного к 3’-концу гена 16S рРНК, и L1 (5’ CAAGGCATCCACCGT 3’), специфичного к 5’-концу гена 23S рРНК [23] проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл 10×Taq-буфера с (NH4)2SO4, 20 mМ MgCl2, 5 мкл 2,5 mМ-ного раствора каждого дНТФ, по 10 пкМ каждого праймера, 0,8 ед. Taq-полимеразы и 1 мкл клеточного лизата, при следующих условиях: начальная денатурация при 94 ºC в течение 2 мин; 30 циклов, состоящих из денатурации при 94 ºC в течение 45 с, отжига при 55 ºC в течение 30 с, элонгации при 72 ºC в течение 40 с; завершающая элонгация при 72 ºC в течение 10 мин.

Рестрикция ПЦР-продуктов. ПЦР-продукты (~1 мкг ДНК) осаждали 2,5 объемами 96 %-ного этанола с добавлением 0,1 объема 3 M-ного Na-ацетата и выдерживали при температуре 20 ºС в течение 1 ч; центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин; промывали осадок 70 %-ным этанолом; высушивали при 50 ºС в течение 10 мин и ресуспендировали в 50 мкл буфера TE. ДНК (100-150 нг) подвергали расщеплению одной из рестриктаз - BseMII, ScaI или Tsp509I («Fermentas», Литва) - в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 ед. эндонуклеазы рестрикции, инкубировали при 37 ºC в течение 2 ч. Фрагменты ДНК анализировали с помощью электрофореза в 3,5 %-ном агарозном геле, окрашивали раствором, содержащим 0,5 мкг/мл бромистого этидия, и отмывали в дистиллированной воде в течение 10 мин при активном покачивании на шейкере. Размеры рестрикционных фрагментов определяли с помощью программного обеспечения Quantity One Software на приборе Gel Doc XR System 170-8170 (Bio-RAD, США). В качестве маркера молекулярных масс фрагментов ДНК использовали «Gene RulerTM 50 bp DNA Ladder» (1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100 и 50 п.н.) (Fermentas, Литва).

Секвенирование последовательностей ДНК

Секвенирование нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов проводили методом Сэнгера на оборудовании ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).

Биоинформационный анализ проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI9 (Invitrogen, США) и BLAST, доступной на вебсайте NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Последовательности генов, размещенные в базе данных GenBank: нуклеотидные последовательности ITS областей L. monocytogenes штаммов 12-IN (KC179818), 13-IN (KC179819) и 4486-1 (KC179820); L. innocua штаммов 3-1 (KC179821) и 4-2 (KC179822); L. ivanovii штамма 11840 (KC179823); L. welshimeri штаммов 4911 (KC192764) и 10 (KC238306) и L. grayi штамма MKM-2 (KC250008).

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШЕСТИ ВИДОВ ЛИСТЕРИЙ МЕТОДОМ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИН РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ПЦР-АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ВНУТРЕННИХ ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРОВ ГЕНОВ 16S-23S РИБОСОМНОЙ РНК  Рисунок 1
Рисунок 1. Алгоритм ПДРФ-ПЦР анализа внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) генов 16S-23S рибосомной РНК листерий: L маркер молекулярных масс фрагментов ДНК «Gene RulerTM 50 bp DNA Ladder» (1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100 и 50 п.н.) (Fermentas, Литва); M L. monocytogenes; In L. innocua; Iv L. ivanovii; S L. seeligeri; W L. welshimeri; G L. grayi. Горизонтальной чертой отмечены образцы, гидролизованные соответствующей эндонуклеазой рестрикции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Предлагаемый нами алгоритм видовой идентификации бактерий рода Listeria разработан на основе биоинформационного анализа 50 последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-локуса), локализованного между генами 16S и 23S рРНК в геномах 48 штаммов: L. monocytogenes (n = 22), L. innocua (n = 7), L. ivanovii (n = 2), L. seeligeri (n = 10), L. welshimeri (n = 6), и L. grayi (n = 1) (таблица 1). Известно, что гены, кодируюшие рРНК, присутствуют в геномах бактерий в нескольких копиях, каждая из которых способна независимо накапливать мутации. Поэтому в некоторых штаммах описаны несколько различающихся последовательностей 16S/23S рРНК ITS-локусов: например, в штамме L. innocua Clip11262 три. На момент проведения анализа в базе данных GenBank найдено 8 вариантов ITS-локусов L. monocytogenes, 7 вариантов - L. innocua, один вариант - L. ivanovii, два варианта - L. seeligeri, 6 вариантов - L. welshimeri и один вариант - L. grayi (таблица 1). Тем не менее, внутривидовое разнообразие ITS-локусов у листерий незначительно по сравнению с межвидовыми различиями этих локусов, что позволило нам разработать алгоритм дифференциации видов листерий на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ПЦР-продуктов, амплифицированных с помощью специфичных праймеров G1 и L1 [23]. Олигонуклеотидные праймеры G1 и L1 комплементарны последовательностям 3’-конца гена 16S рРНК и 5’-конца гена 23S рРНК, рРНК, соответственно. С помощью данных праймеров происходит наработка двух ПЦР-продуктов – «малого» размером ~300 п.н. и «большого» размером ~600 п.н., что объясняется наличием генов изолейциновой тРНК или аланиновой тРНК, встроенных в некоторые копии 16S/23S рРНК ITS-локусов [25]. Объектом разработанного ПДРФ-анализа является ПЦР-продукт размером ~300 п.н., однако анализ одинаково эффективен как для «малого» фрагмента ДНК, изолированного из геля, так и в присутствии «большого» фрагмента, который не гидролизуется используемыми в анализе рестрикционными эндонуклеазами.

Типы ITS-локусовРестрикционные эндонуклеазы/Размеры фрагментов ДНКШтаммыСсылки на базу данных NCBI
BseMII ScaI Tsp509I
L. monocytogenes 1199; 134218; 115176; 118; 39EGD-e; ATCC 15313; L312; SLCC2540; SLCC2378; ATCC19117; 07PF0776; Clip80459; F2365; SLCC2482; SLCC2755; SLCC2376; BCRC14846AL591974; U44062; FR733642; FR733645; FR733644; FR733643; CP003414; FM242711; AE017262; FR720325; FR733646; FR733651; AY684791
L. monocytogenes 2199; 134218; 115176; 118; 39ATCC19118; ATCC49594L05172; U78980
L. monocytogenes 3199; 134218; 115180; 114; 39M7CP002816
L. monocytogenes 4199; 134218; 115180; 114; 39L99FM211688
L. monocytogenes 5199; 134218; 115180; 114; 39HCC23CP001175
L. monocytogenes 6199; 134; 18236; 115194; 114; 39ATCC49594 (Scott A)U44063
L. monocytogenes 7201; 134220; 115176; 120; 39L-emoAF514303
L. monocytogenes 8200; 134219; 115180; 115; 39L349AF514302
L. innocua 1334219; 115177; 118; 39NCTC11288U57914
L. innocua 2334219; 115177; 118; 39Clip11262AL596164; AL596170
L. innocua 3334219; 115177; 118; 39Clip11262AL596173
L. innocua 4334219; 115177; 118; 39Clip11262AL596172
L. innocua 5334219; 115177; 118; 39NCTC11288U57915
L. innocua 6334219; 115177; 118; 3900-132GQ919063
L. innocua 7334219; 115177; 118; 39L68GQ919062
L. ivanovii 1334334183; 112; 39PAM55; ATCC19119FR687253; U57913; U78981
L. seeligeri1334334234; 39; 33; 28SLCC3954; ATCC35976; ATCC35967; LS-158; LS-165; LS-159; SE-107; SE-116; 00-134FN557490; U57916; U78984; DQ065845; DQ065843; DQ065842; DQ065840; DQ065841; DQ065839; GQ919064
L. seeligeri 2334334234; 39; 33; 282436KADQ065844
L. welshimeri 1333333180; 61; 53; 39GIMHQ389226
L. welshimeri 2333333180; 61; 53; 39SLCC5334AM263198
L. welshimeri 3333333180; 53; 39; 33; 28ATCC35897U78982
L. welshimeri 4333333180; 61; 53; 3900-133GQ919065
L. welshimeri 5333333180; 61; 53; 39ATCC35897U57917
L. welshimeri 6333333294; 39ATCC35897DQ065846
L. grayi 1322322322ATCC19120U78983
Таблица 1 . Перечень проанализированных in situ последовательностей ITS-локусов генов 16S-23S рРНК.

Первый этап алгоритма гидролиз ПЦР-продуктов эндонуклеазой рестрикции BseMII, который позволяет дифференцировать листерии патогенного для человека вида L. monocytogenes, поскольку их ПЦР-продукты гидролизуются данной рестриктазой, а ПЦР-продукты листерий других видов – нет (таблица 1, рисунок 1). Второй этап алгоритма – гидролиз ПЦР-продуктов, негидролизующихся на первом этапе, эндонуклеазой рестрикции ScaI. На этом этапе идентифицируются листерии вида L. innocua, так как только для их ПЦР-продуктов характерно наличие гидролиза. Третий этап алгоритма – обработка ПЦР-продуктов эндонуклеазой рестрикции Tsp509I, которая позволяет идентифицировать остальные четыре вида листерий - патогенный для животных L. ivanovii и непатогенные L. seeligeri, L. welshimeri и L. grayi. При этом ПЦР-продукты L. grayi не гидролизуются, а ПЦР-продукты L. ivanovii, L. seeliger и L. welshimeri гидролизуются с образованием фрагментов характерных размеров (таблица 1, рисунок 1).

Разработанный подход использован для идентификации 66 штаммов листерий, выделенных из пищевых продуктов в ходе исследования в 2003-2013 гг., а также верифицирован на штаммах, полученных из коллекций микроорганизмов (таблица 2): L. grayi (n=5), L. innocua (n=19), L. ivanovii (n=3), L. monocytogenes (n=33), L. seeligeri (n=2) и L. welshimeri (n=4). Для данных штаммов изучены биохимические и культуральные характеристики, а также чувствительность к антибактериальным препаратам. Показано, что 21 % штаммов устойчивы к ампициллину, 30 % - к пенициллину, 20 % - к ко-тримоксазолу; 100 % штаммов чувствительны к эритромицину и меропенему.

Совпадение результатов видовой идентификации с помощью биохимических тестов, масс-спектрометрии и ПДРФ-ПЦР анализа составило 100 %. В заключение следует отметить, что описанный алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа 16S/23S рРНК ITS-локусов листерий является относительно простым и может быть использован специалистами для быстрой дифференциации патогенных и непатогенных представителей данного рода.

№ п/п Вид микроорганизма Штамм Источник выделения (год) Биохимические и культуральные характеристики Устойчивость к антибактериальным препаратам* Источник получения [cсылка]
Ферментация сахаров БГКТ Усиление гемолиза Гидролиз лецитина
КMРReSaC-C+
1L. grayiC214НД+-++------CTZВГНКИ
2L. grayiMKM1Мясо-костная мука (2010)+-++------CTZГНЦ ПМБ
3L. grayiMKM2AМясо-костная мука (2010)+-++-------ГНЦ ПМБ
4L. grayiMKM2БМясо-костная мука (2010)+-++-------ГНЦ ПМБ
5L. grayiMKM3Мясо-костная мука (2010)+-++-------ГНЦ ПМБ
6L. inocuaNCTC11288Мозг коровы (1979)---±-------NCTC [25]
7L. inocuaK644НД (2003)---±-------ГНЦ ПМБ
8L. inocua1НД (2003)---±------PENГНЦ ПМБ
9L. inocua1-36НД (2003)---±------PENГНЦ ПМБ
10L. inocua2НД (2003)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
11L. inocua3-1Фарш для сырокопченых колбас (2003)---±------PENНИИ питания
12L. inocua4-2Полуфабрикаты свиные (2003)---±------AMP, PENНИИ питания
13L. inocua381НД (2004)---±------PENГНЦ ПМБ
14L. inocua382НД (2004)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
15L. inocuaCM1НД (2004)---±-------ГНЦ ПМБ
16L. inocua29ИПКолбаса сырокопченая (2004)---±------AMP, PENНИИ питания
17L. inocua32ИПСмыв с разделочной доски для мяса (2004)---±------AMPНИИ питания
18L. inocua2012-1Тушка цыпленка (2012)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
19L. inocua2012-9Мясной фарш (2012)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
20L. inocua2012-22Мясной фарш (2012)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
21L. inocua2012-30Мясной фарш (2012)---±------AMP, PENГНЦ ПМБ
22L. inocuaМСЧ-164Сельдь (2012)---±------PENГНЦ ПМБ
23L. inocuaС-П 114/7Продукты (2013)---±-------ГНЦ ПМБ
24L. inocuaС-П 115/7Продукты (2013)---±------AMPГНЦ ПМБ
25L. ivanovii4912НД (2008)--+-+++-++-ГНЦ ПМБ
26L. ivanovii11840НД (2008)--+-+++-++CTZГНЦ ПМБ
27L. ivanoviiATCC19119НД--+-+++-++CTZATCC [27]
28L. monocytogenesEGD-eНД (1926)--++++-+-+CTZATCC [28]
29L. monocytogenesNCTC10527Дериват NCTC10225 (1967)--++++-+-+-NCTC
30L. monocytogenesGIM003НД--++++-+-+-НИИЭМ
31L. monocytogenesAНД--++++-+-+-НИИЭМ
32L. monocytogenes766НД--++++-+-+CTZНИИЭМ
33L. monocytogenesNCTC10357Кролик (1926)--++++-+-+-NCTC [29]
34L. monocytogenesC664НД--++++-+-+CTZВГНКИ
35L. monocytogenesC52НД--++++-+-+-ВГНКИ
36L. monocytogenesNCTC11994Мягкий сыр (1986)--++++-+-+CTZNCTC
37L. monocytogenesNCTC7973Морская свинка (1926)--++++-+-+-NCTC [29]
38L. monocytogenes4908НД (2004)--++++-+-+PENГНЦ ПМБ
39L. monocytogenes4909НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
40L. monocytogenes4910НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
41L. monocytogenes4913НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
42L. monocytogenes944НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
43L. monocytogenes№2Говядина (2004)--++++-+-+-НИИ питания
44L. monocytogenes№4НД (2004)--++++-+-+-НИИ питания
45L. monocytogenes№6Полуфабрикаты мясные говядина (2004)--++++-+-+-НИИ питания
46L. monocytogenesM-1НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
47L. monocytogenesM-2НД (2004)--++++-+-+PENГНЦ ПМБ
48L. monocytogenesM-3НД (2004)--++++-+-+AMPГНЦ ПМБ
49L. monocytogenesM-5НД (2004)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
50L. monocytogenesM-6НД (2004)--++++-+-+CTZГНЦ ПМБ
51L. monocytogenes4ИПКолбаса сырокопченая (2004)--++++-+-+AMP, PENНИИ питания
52L. monocytogenes12ИПКолбаса сырокопченая (2004)--++++-+-+AMP, PENНИИ питания
53L. monocytogenes13ИПСвинина охлажденная (2003)--++++-+-+-НИИ питания
54L. monocytogenes20ИПСмыв с ножа в цеху по производству сырокопченых колбас (2003)--++++-+-+-НИИ питания
55L. monocytogenes46ИПСмыв с разделочной доски в мясоперерабатывающем комбинате (2004)--++++-+-+CTZНИИ питания
56L. monocytogenes53ИПСмыв с оборудования мясокомбината (2003)--++++-+-+AMP, PENНИИ питания
57L. monocytogenes61ИПСмыв с инвентаря  цеха мясных полуфабрикатов (2004)--++++-+-+CTZНИИ питания
58L. monocytogenes766ИПНД (2004)--++++-+-+-НИИ питания
59L. monocytogenes4486Колбаски (2012)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
60L. monocytogenes4701Тушки цыплят (2012)--++++-+-+-ГНЦ ПМБ
61L. seeligeriSLCC3954 (NCTC 11856)Почва, 1983-++-++-+--CTZNCTC [30]
62L. seeligeriSLCC5981НД-++-++-+--CTZНИИЭМ
63L. welshimeri4911НД (2008)-+-±------PENГНЦ ПМБ
64L. welshimeri10НД (2008)-+-±------PENГНЦ ПМБ
65L. welshimeri47Смыв с рабочего стола цеха мясных полуфабрикатов (2004)-+-±-------НИИ питания
66L. welshimeriИПМинтай замороженный (2004)-+-±-------НИИ питания
Таблица 2. Характеристика штаммов листерий, использованных в работе.
Примечания: Mт – маннит; К – ксилоза; М – манноза; Р- рамноза; БГ - бета-гемолиз; КТ - КАМП-тест; Re - Rhodococcus equi; Sa - Staphylococcus aureus; C- - без угля; C+ - с углем;
ВГНКИ Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»;
ГНЦ ПМБ Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора;
НИИ питания РАМН Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук;
НИИЭМ – Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Почетного академика Н.Ф. Гамалеи»;
*Набор использованных препаратов: АMP – ампициллин, PEN – пенициллин, ERI – эритромицин, MER – меропенем, CTZ – ко-тримоксазол;
НД – нет данных; «+» наличие признака; « » отсутствие признака.
ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм дифференциации шести видов листерий с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-ПЦР) внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS-локусов) генов 16S/23S рРНК, включающий в себя три последовательных этапа гидролиза ПЦР-продуктов, наработанных с помощью специфичных праймеров G1 и L1, эндонуклеазами рестрикции BseMII, ScaI и TasI.

2. Алгоритм апробирован на штаммах идентифицированных ранее видов листерий, полученных из коллекций микроорганизмов и выделенных из пищевых продуктов в ходе исследования в 2003-2013 гг.: L. grayi (n=5), L. innocua (n=19), L. ivanovii (n=3), L. monocytogenes (n=33), L. seeligeri (n=2) и L. welshimeri (n=4); совпадение результатов ПДРФ-ПЦР-идентификации с результатами идентификации методами биохимических тестов и MALDI-TOF составило 100 %.

Работа выполнена в рамках Федеральной НИР № 037 «Совершенствование методов идентификации и изучение биологических, молекулярно-генетических, биохимических характеристик возбудителей клостридиозов, легионеллеза и листериоза и др. бактериальных пищевых инфекций, в том числе культур с атипичными свойствами». Секвенирование ДНК проводили в научно-производственной компании «Синтол», Москва (http://www.syntol.ru).

Информация об авторах

Пачкунов Дмитрий Михайлович (Pachkunov D.M.) – к.б.н., ст. научн. сотр. лаб. антимикробных препаратов; Асташкин Евгений Ильич (Astashkin E.I.) - к.б.н., вед. научн. сотр. лаб. антимикробных препаратов; Карцев Николай Николаевич (Kartsev N.N.) - мл. научн. сотр. лаб. антимикробных препаратов; Борзенков Валерий Николаевич (Borzenkov V.N.) - к.б.н., ст. научн. сотр. лаб. антимикробных препаратов; Тазина Ольга Ивановна (Tazina O.I.) - лаб.-исследователь лаб. антимикробных препаратов; Ковалев Юрий Николаевич (Kovalev Yu.N.); Ефимочкина Наталья Рамазановна (Efimochkina N.R.) – д.б.н., вед. научн. сотр. лаб. биобезопасности и анализа нутримикробиома karlikanova@ion.ru; Мицевич Ирина Петровна (Mitsevich I.P.) - научн. сотр. лаб. антимикробных препаратов; Светоч Эдуард Арсеньевич (Svetoch E.A.), д.б.н., профессор, зав. отделом молекулярной микробиологии; Дятлов Иван Алексеевич (Dyatlov I.A.), д.м.н., профессор, чл.-корр. РАМН, директор; Фурсова Надежда Константиновна (Fursova N.K.), к.б.н., зав. лаб. антимикробных препаратов n-fursova@yandex.ru

Ссылки
  1. Liu D. Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. J Med Microbiol. 2006;55:645-59 pubmed
  2. Graves L, Helsel L, Steigerwalt A, Morey R, Daneshvar M, Roof S, et al. Listeria marthii sp. nov., isolated from the natural environment, Finger Lakes National Forest. Int J Syst Evol Microbiol. 2010;60:1280-8 pubmed publisher
  3. Leclercq A., Clermont D., Bizet C., Grimont P.A.D., Le Flèche-Matéos A., Roche S.M., Buchrieser C., Cadet-Daniel V., Le Monnier A., Lecuit M., Allerberger F. Listeria rocourtiae sp. nov. Int. J. System. Evolut. Microbiol. 2010; 60:2210-2214.
  4. Bertsch D, Rau J, Eugster M, Haug M, Lawson P, Lacroix C, et al. Listeria fleischmannii sp. nov., isolated from cheese. Int J Syst Evol Microbiol. 2013;63:526-32 pubmed publisher
  5. Lang Halter E, Neuhaus K, Scherer S. Listeria weihenstephanensis sp. nov., isolated from the water plant Lemna trisulca taken from a freshwater pond. Int J Syst Evol Microbiol. 2013;63:641-7 pubmed publisher
  6. Charlier C, Goffinet F, Azria E, Leclercq A, Lecuit M. Inadequate management of pregnancy-associated listeriosis: lessons from four case reports. Clin Microbiol Infect. 2014;20:246-9 pubmed publisher
  7. Rocourt J, Hogue A, Toyofuku H, Jacquet C, Schlundt J. Listeria and listeriosis: risk assessment as a new tool to unravel a multifaceted problem. Am J Infect Control. 2001;29:225-7 pubmed
  8. Goulet V, King L, Vaillant V, de Valk H. What is the incubation period for listeriosis?. BMC Infect Dis. 2013;13:11 pubmed publisher
  9. Guillet C, Join-Lambert O, Le Monnier A, Leclercq A, Méchaï F, Mamzer-Bruneel M, et al. Human listeriosis caused by Listeria ivanovii. Emerg Infect Dis. 2010;16:136-8 pubmed publisher
  10. Rapose A, Lick S, Ismail N. Listeria grayi bacteremia in a heart transplant recipient. Transpl Infect Dis. 2008;10:434-6 pubmed publisher
  11. Rocourt J., Hof H., Schrettenbrunner A., Malinverni R., Bille J. Acute purulent Listeria seeligeri meningitis in an immunocompetent adult. Schweiz. Med. Wochenschr. 1986; 116:248-241.
  12. Perrin M, Bemer M, Delamare C. Fatal case of Listeria innocua bacteremia. J Clin Microbiol. 2003;41:5308-9 pubmed
  13. Swaminathan B, Gerner-Smidt P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 2007;9:1236-43 pubmed
  14. Little C, Sagoo S, Gillespie I, Grant K, McLauchlin J. Prevalence and level of Listeria monocytogenes and other Listeria species in selected retail ready-to-eat foods in the United Kingdom. J Food Prot. 2009;72:1869-77 pubmed
  15. Katharios-Lanwermeyer S, Rakic-Martinez M, Elhanafi D, Ratani S, Tiedje J, Kathariou S. Coselection of cadmium and benzalkonium chloride resistance in conjugative transfers from nonpathogenic Listeria spp. to other Listeriae. Appl Environ Microbiol. 2012;78:7549-56 pubmed publisher
  16. Collins-Thompson D, Slade P, Goethals M. Use of low molecular mass RNA profiles to identify lactic acid bacteria and related organisms associated with foods. Int J Food Microbiol. 1991;14:135-43 pubmed
  17. Ji Y, Kempsell K, Colston M, Cox R. Nucleotide sequences of the spacer-1, spacer-2 and trailer regions of the rrn operons and secondary structures of precursor 23S rRNAs and precursor 5S rRNAs of slow-growing mycobacteria. Microbiology. 1994;140:1763-73 pubmed
  18. Kupradit C, Rodtong S, Ketudat-Cairns M. Development of a DNA macroarray for simultaneous detection of multiple foodborne pathogenic bacteria in fresh chicken meat. World J Microbiol Biotechnol. 2013;29:2281-91 pubmed publisher
  19. Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 1994;32:335-51 pubmed
  20. Jensen M, Webster J, Straus N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Appl Environ Microbiol. 1993;59:945-52 pubmed
  21. Xiao L, Zhang L, Wang H. Critical issues in detecting viable Listeria monocytogenes cells by real-time reverse transcriptase PCR. J Food Prot. 2012;75:512-7 pubmed publisher
  22. Barry T, Colleran G, Glennon M, Dunican L, Gannon F. The 16s/23s ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Appl. 1991;1:51-6 pubmed
  23. Drebot M, Neal S, Schlech W, Rozee K. Differentiation of Listeria isolates by PCR amplicon profiling and sequence analysis of 16S-23S rRNA internal transcribed spacer loci. J Appl Bacteriol. 1996;80:174-8 pubmed
  24. Gurtler V, Stanisich V. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology. 1996;142:3-16 pubmed
  25. Graham T, Golsteyn-Thomas E, Thomas J, Gannon V. Inter- and intraspecies comparison of the 16S-23S rRNA operon intergenic spacer regions of six Listeria spp. Int J Syst Bacteriol. 1997;47:863-9 pubmed
  26. Rasheed J, Jay C, Metchock B, Berkowitz F, Weigel L, Crellin J, et al. Evolution of extended-spectrum beta-lactam resistance (SHV-8) in a strain of Escherichia coli during multiple episodes of bacteremia. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41:647-53 pubmed
  27. Böhme K, Fernández-No I, Barros-Velázquez J, Gallardo J, Canas B, Calo-Mata P. Rapid species identification of seafood spoilage and pathogenic Gram-positive bacteria by MALDI-TOF mass fingerprinting. Electrophoresis. 2011;32:2951-65 pubmed publisher
  28. Glaser P, Frangeul L, Buchrieser C, Rusniok C, Amend A, Baquero F, et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 2001;294:849-52 pubmed
  29. Murray, E. G. D., Webb R.A., Swann M.B.R. A disease of rabbits characterized by large mononuclear leukocytosis caused by ahitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes J. Path. Bact. 1926; 29:407-439.
  30. Steinweg C, Kuenne C, Billion A, Mraheil M, Domann E, Ghai R, et al. Complete genome sequence of Listeria seeligeri, a nonpathogenic member of the genus Listeria. J Bacteriol. 2010;192:1473-4 pubmed publisher
ISSN : 2334-1009