Субклеточное фракционирование (фракционирование органелл)
Parisis Nikos (nnparisis at gmail dot com)
National Institute for Agricultural Research, Montpellier, France
Перевод
Aleksei Stepanenko (a dot a dot stepanenko at gmail dot com)
Laboratory of Biosynthesis of Nucleic Acids, Department of Functional Genomics, 150 Zabolotnogo Street, Kyiv 03680, Ukraine
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.ru.3.562
Дата
последнего обновления : 2016-10-14; оригинальная версия : 2013-10-31
Цитировать как
MATER METHODS ru 2013;3:562
Абстракт

Методы субклеточного фракционирования. Обзор

English Abstract

An overview of subcellular fractionation methods.

Отделение клеточных компартментов/органелл друг от друга является важным шагом для изучения внутриклеточных структур, белков или для оценки возможных связей между макромолекулярными структурами. Субклеточное фракционирование основано на различиях в плавучей плотности, поверхностной плотности заряда, размере и форме, и, главным образом, на дифференциальном центрифугировании в средах с высокой вязкостью при температуре 4°C. Среда, используемая для дифференциального центрифугирования, в основном представляет собой сахарозу, маннит, глицерин, Ficoll 400 (полимер сахарозы), Перколл (коллоидный диоксид кремния) и иодиксанол (OptiPrep). Сахароза широко используется, поскольку недорогая. Все эти среды имеют свои преимущества и недостатки, которые обсуждаются подробно Harford и Bonifacino, 2011. Данные методы будут обсуждаться и здесь, с предпочтением для тех, которые легко доступны для большинства лабораторий и требуют меньше времени для приготовления. Гель-фильтрация, аффинная хроматография, электрофорез также могут быть использованы. Вариации в протоколах зависят от органелл, ткани или типа клеток и используемого оборудования, и настоятельно рекомендуется прочитать приведенную по ссылкам литературу для получения детальной информации о каждой процедуре. В конце концов, чистоту и выход фракционирования следует оценивать путем выявления различных маркеров в каждой фракции, собранной в течение всей процедуры.

Далее представлены наиболее часто используемые методы для выделения органелл. Использование печени крыс подробно обсуждалось и может быть легко найдено в литературе. Поэтому в центре внимания этой части обзора будут другие модельные системы.

Выделение цитоплазмы, нуклеоплазмы и хроматина

Цитоплазматическая, нуклеоплазматическая и хроматиновые фракции могут быть легко получены из центрифужного осадка культивируемых клеток [1]. Клетки ресуспендируют в буфере, содержащем 0.34 М сахарозу, 10% глицерин и низкую концентрацию мягкого детергента (0.1% Тритон Х-100), а также K+ и Mg+2 (который защищает ядра от разрушения), и ядра осаждаются центрифугированием при низкой скорости, а в супернатанте остается цитоплазматическая фракция. Затем ядра лизируют буфером, содержащем хелатирующие агенты EDTA и EGTA, и нерастворимую хроматиновую фракцию осаждают центрифугированием при малой скорости, а надосадочная жидкость представляет собой нуклеоплазматическую фракцию [1] (Рисунок 1).

Субклеточное фракционирование (фракционирование органелл) Рисунок 1
Рисунок 1. Схематичное изображение субклеточного фракционирования культивируемых клеток, предложенное Мендес и Стиллман [1].

Некоторые исследователи используют "быстрый и грязный" метод получения хроматина и связанных с ним белков из цитоплазмы/нуклеоплазмы. Достигается это путем лизиса клеток буфером, содержащем 1% Тритон Х-100. В этом буфере хроматин и некоторые структуры цитоскелета нерастворимы, и они могут быть извлечены с помощью центрифугирования. Осадок может быть повторно ресуспендирован в буфере, например, Laemmli для SDS-PAGE [2].

Выделение митохондрий дифференциальным центрифугированием

1. Осадок клеток, выращенных в виде монослоя или в суспензии, гомогенизируют в буфере для гомогенизации, содержащем MgCl2 и KCl. Позже добавляется сахароза до 0.25 М, и ядра осаждаются центрифугированием при низкой скорости (1000 g). Второе центрифугирование супернатанта при 5000 g осаждает митохондрии. Осадок вновь ресуспендируют в среде, содержащей сахарозу и Mg+2 и подвергают нескольким ударам в гомогенизаторе Даунса. Последний шаг центрифугирования при 5000 g обогащает митохондрии, которые могут быть повторно ресуспендированы в буфере, содержащем Трис-0,25 М сахарозу, или в другом желаемом буфере для последующего анализа (например Лэммли) [3].

2. Дрожжевые клетки обрабатывают зимолазой, чтобы разрушить твердую внешнюю стенку и произвести сферопласт, который промывается в буфере сорбита. Осадок ресуспендируют в буфере для гомогенизации, содержащем 0,6 М маннитол и клетки лизируют несколькими ударами в гомогенизаторе Даунса. Ядра удаляют центрифугированием при низкой скорости, в то время как цитоплазму, содержащую надосадочную жидкость, центрифугируют при 6500 g в роторе с фиксированным углом до появления осадка митохондрий.

Кроме того, существуют протоколы, которые используют разделение в градиенте плотности, давая более чистые митохондриальные фракции, но они занимают больше времени. Несмотря на "загрязнения" лизосомами и пероксисомами фракций, полученных дифференциальным центрифугированием, этот метод чаще используется. Таким образом, требуемая чистота препарата определяет наиболее подходящий протокол. Например, если представляют интерес метаболические исследования, тогда предпочтительным будет дифференциальное центрифугирование. В качестве альтернативы, если в центре исследования находится точная локализация белка или необходимы образцы в самой чистой форме, например, для протеомного анализа, препараты, полученные в градиенте плотности, являются более подходящими.

Изоляция пероксисом

Smith et al [4] использовали постнуклеарную надосадочную жидкость, полученную 2000 g центрифугированием, которую затем повторно центрифугируют при 20.000 g в течение 30 мин. Осадок, который содержал пероксисомы и митохондрии, ресуспендировали в MS-буфере (0.65 М сорбитол, 5 мМ MES, рН 5.5) и помещали на вершину градиента Nycodenz (17%, 25%, 35%, 50%) в MS буфер. После центрифугирования при 116.000 g в течение 2 ч пероксисомы присутствуют во фракциях 2-8.

Дальнейшее разделение пероксисомных белков, ассоциированных с мембраной, было достигнуто Fujiki (1982) и Nuttley и др. (1990) [4]. Осадок от вышеупомянутого 20.000 g центрифугирования ресуспендировали в 10 объемах буфера Ti8 (Трис 10 мМ, рН 8,0 и PINS (1 мМ ЭДТА, 0,2 мМ PMSF, 2 мкг лейпептина/мл, 2 мкг апротинина/мл и 0,4 мкг пепстатин А/мл) и разделяли при 200.000 g в течение 1 ч. Осадок с мембранами пероксисом снова ресуспендировали в буфере Ti8, добавляли 0.1 М карбонат натрия и центрифугировали при 200.000 g в течение 1 ч. Мембраны пероксисом отделяли от белков, которые были связаны с ней, но не являлись интегральными.

Выделение лизосом (из культивируемых клеточных линий)

Лизосомы, митохондрии и пероксисомы имеют очень близкие плотности в градиентах сахарозы. Поэтому предпочтительно избегать этот метод. В Percoll они более плотные, и такой метод дает лизосомы практически без загрязнения другими органеллами.

Промытые клетки гомогенизируют 5 проходами через гомогенизатор в 3 мл буфера, содержащем 0.25 М сахарозы. 800 g центрифугирование в течение 10 мин осаждает интактные ядра и дебрис, а надосадочную жидкость хранят на льду. Ядерный осадок ресуспендировали в 0.5 мл того же буфера, повторно центрифугировали, как и раньше, и супернатант объединяли с супернатантом первого центрифугирования. В этот раствор добавляют стоковый раствор Percoll (содержащий 0.25% сахарозу) и бычий сывороточный альбумин (BSA) до конечной концентрации 20% (примечание: она может быть увеличена до 27%-35%) и 0.4%, соответственно (окончательный объем 4.5 мл), и центрифугировали при 36.000 g в течение 30 мин (примечание: может варьировать от 15.000 g в течение 60 мин до 62.500 g в течение 40 мин). С использованием разгрузчика градиента градиент собирают в 0.4 мл фракции, и лизосомы, как правило, близки к нижней части градиента. Для того, чтобы лучше растворять лизосомы и увеличить выход, NP-40 добавляют в конечной концентрации 0.5% перед центрифугированием при 100.000 g в течение 1-2 ч. Но если неповрежденные органеллы представляют интерес, например, для метаболических анализов, NP-40 следует избегать [5].

Выделение меланосом

Kushimoto et al и Basrur et al использовали прерывистый градиент сахарозы в HEPES буфере [6, 7]. Более конкретно, клеточный лизат ресуспендировали в 2 М сахарозе и наслаивали поверх ступенчатого градиента сахарозы (1.0, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 М). После центрифугирования со скоростью 100.000 g в течение 1 ч меланосомы ранней стадии (стадии I и II) были обнаружены в зоне около 1.0-1.2 М сахарозы. Эту обогащенную фракцию далее разделяют на богатую тирозиназой и богатую белками фракцию посредством свободного проточного электрофореза (FFE) на аппарате Octopus-PZE FFE при 2.0 мл/ч. FFE проводили при 1000-1100 В и ≈110-125 мА с использованием 0.25 М сахарозы в триэтаноламине, рН 7.4 при скорости потока элюирования 3-4 мл/минута [7]. Эта процедура дала высокое обогащение образца меланосом для протеомного анализа, который детектировал > 60 меланосомальных белков [6].

Другой протокол, который дает меланосомальную фракцию с высокой степенью чистоты, был разработан теми же исследователями. Клеточный лизат в 2 М сахарозе наслаивали на дно ступенчатого градиента сахарозы. После центрифугирования при 100.000 g в течение 1 ч меланосомы ранних этапов, которые были обнаружены в зоне около 1 М сахарозы, затем наслаивали в середину увеличенного градиента 0.8, 1.0 и 1.2 М сахарозы и центрифугировали снова при тех же условиях, что и прежде. Этот дополнительный шаг полностью удалял митохондриальное "загрязнение".

Поздние меланоциты (стадия III и IV) также были извлечены из слоя 1.8 М сахарозы, поскольку они содержали большее количество меланина и, таким образом, были более тяжелыми.

Очистка экзосом

Welton et al очистили экзосомы из культуральной среды клеточной линии рака мочевого пузыря HT1376 [8]. После удаления клеток центрифугированием (400 g в течение 10 мин) и клеточного дебриса (2000 g в течение 15 мин, а затем 10.000 g в течение 30 мин) супернатант подвергали высокоскоростному центрифугированию (100.000 g в течение 2 ч) путем наслаивания на 30% сахарозу в окиси дейтерия (D2O или тяжелая вода). После промывки PBS осадок содержал экзосомы.

Hogan et al выделили экзосомы из мочи следующим методом [9]. Образец мочи осветляли15.000 g центрифугированием и пропускали через нейлоновый фильтр 8 мкм перед повторным центрифугированием при 150.000 g в течение 1 ч. Осадок содержал экзосомоподобные везикулы и белок везикул Tamm-Horsfall (ТНР, или уромодулин), основной белок в моче. Чтобы удалить ТНР, образец наслаивали поверх прерывистого градиента сахарозы (5-30%) в D2O с рН 6,0. После центрифугирования при 200.000 g в течение 24 ч образец собрали в 14 равные фракции. Каждую фракцию разбавляли в 5-10 раз в PBS и повторно центрифугировали при 150.000 g в течение 1 ч и получали осадок чистых экзосом.

Экстракция гистонов

Гистоны являются самыми основными белками во внутриклеточной среде. Эта характеристика используется для обогащения гистонов из клеток или экстрактов Xenopus laevis. Ресуспендируя интактные, очищенные ядра (как описано выше) в 0.2 М серной кислоте (H2SO4) и после инкубации путем вращения при 4°C, большинство клеточных белков выпадают в осадок, в то время как гистоны остаются растворимыми и осаждаются центрифугированием при 16.000 g в течение 15 мин [10]. В качестве альтернативы хроматизированные гистоны могут быть извлечены с помощью инкубирования в 2.5 М NaCl.

Очистка мембран Гольджи (из мышиной печени)

Chen et al использовали метод для изоляции мембран Гольджи [11]. Гомогенат ткани печени, приготовленный в буфере, содержащем 0.5 М сахарозы, наслаивали поверх 0.86 М сахарозы и закупоривали 0.25 М сахарозой. После центрифугирования при 103.800 g в течение 60 мин мембраны собирали на границе раздела 0.5-1.3 М и доводили до 0.5 М сахарозы.

Изоляция центросом

Центросомы могут быть выделены из прикрепленных эпителиальных культивированных клеток, однако, не в больших количествах. Andersen et al использовали более 2 миллиардов клеток (2x109) [12]. Ядра выделяли гипотоническим лизисом и центросомы собирали после двух стадий центрифугирования. Во-первых, с помощью центрифугирования на 50% подушку сахарозы и затем центрифугированием на 40%, 50% и 70% градиенте сахарозы.

Moritz et al have isolated centrosomes from drosophila embryos as follows: a homogenate (in BRB80 buffer+100mM KCl and 14% sucrose) from 3.5h embryos was centrifuged at 1,500 g for 10 min and the lipids were removed. The supernatant was used to isolate centrosomes after additio

Moritz et al выделил центросомы эмбрионов дрозофилы следующим образом: гомогенат (в BRB80 буфере + 100 мМ KCl и 14% сахароза) из 3.5 ч эмбрионов центрифугировали при 1.500 g в течение 10 мин, липиды были удалены. Супернатант использовали для выделения центросом после добавления 0.1-0.5% Тритона Х-100 и 50% сахарозы (конечные концентрации) путем загрузки на градиент сахарозы (4 мл 55% и 3 мл 70%) и центрифугировали при 100.000 g в течение 90 мин. Большинство центросом скапливалось на верхней части 70% подушки [13].

Изолирование псевдоподий

Мигрирующие клетки образуют удлинение на одной стороне, которое прикрепляется к новым местам, чтобы подтянуть остальную часть тела клетки на новый сайт. Это удлинение называется ложноножками. Klemke и коллеги [14] разработали метод для изолирования псевдоподии из тела клетки в ответ на хемотактической агент. Это достигается за счет использования камер для Transwell миграции в 6- или 24-луночном планшете. Коротко, клетки оставляют для прикрепления на верхней стороне фильтра, который имеет небольшие поры, 3 мкм. Они достаточно малы, так что целые клетки не могут пройти. Но сформированные псевдоподии могут проходить, и они будут прикрепляться на нижней стороне фильтра, когда клетки реагируют на хемотаксический агент, который был помещен в нижнем отсеке. Затем клетки фиксировали, и псевдоподии или тела клеток могут быть собраны путем лизиса в буфере а [15].

Фракционирование цитозоля, ядер, шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума, плазматичекой мембраны, митохондрий.

Song et al выполнили внутриклеточное фракционирование печени мышей, но этот метод также может быть использован и для других тканей после некоторых модификаций [16]. Схема на рисунке 2 суммирует всю процедуру. Вкратце, гомогенат печени центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин, чтобы отделить осадок (Р1) и растворимую фракцию (S1).

Субклеточное фракционирование (фракционирование органелл) Рисунок 2
Рисунок 2. Схематичное изображение субклеточного фракционирования тканей печени мыши, предложенное Song et al [16].

Р1 ресуспендировали в буфере, содержащем 1.8 М сахарозу, центрифугировали при 70.900 g в течение 90 мин и получали осадок (P2) с ядрами клеток печени, который может храниться, и растворимую фракцию между интерфейсом 0.25-1.8 M (S2). S2 ресуспендировали в 0.25 М сахарозе, центрифугировали при 1200 g в течение 10 мин и осадок, содержащий плазматическую мембрану, дополнительно ресуспендировали в буфере, содержащем 1.45 М сахарозу, и центрифугировали при 68.400 g в течение 60 мин. В растворимую фракцию между 0.25-1.45 М сахарозы добавляли буфер, содержащий 0.25 М сахарозу, и повторно центрифугировали при 17.600 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 1.35 М сахарозу, и центрифугировали при 230.000 g в течение 60 мин. 0.25-1.35 М фракцию изымали, разбавляли с помощью 0.25 М сахарозы и повторно центрифугировали при 40.000 g. Последующий осадок содержал очищенный белков плазматической мембраны.

Растворимую фракцию S1 повторно центрифугировали при 8000 g в течение 15 мин. Так получали нерастворимую фракцию (P5), которая содержала митохондрии, и растворимую фракцию (S5), содержащую ЭР (легкие и тяжелые микросомы), а также комплекс Гольджи.

После промывки Р5 снова суспендировали в 12 мл раствора, содержащего 25% Nycodenz [17] и наслаивали на ступенчатый градиент Nycodenz (5 мл 34% и 8 мл 30% -ного) и закупоривали 8 мл 23% и 3 мл 20%. После центрифугирования при 52.000 g в течение 90 мин митохондрии обнаруживали на границе 25-30%. Эту фракцию собирали и разводили в буфере (200 мМ маннит и 50 мМ сахароза) перед центрифугированием при 15.000 g в течение 20 мин. Полученный в результате осадок, содержащий чистые митохондрии, промывали и хранили.

Растворимую фракцию S5 центрифугировали при 34.000 g в течение 30 мин и получали осадок (Р6) и растворимую фракцию с легкими микросомами (S4). S4 центрифугировали при 124.000 g , чтобы отделить цитозоль, который сохраняли, от микросом (осадок). Р6 смешивали с легкими микросомами из предыдущего центрифугирования и разбавляли в буфере, содержащем 0.25 М сахарозу и 0.015 М CsCl. Раствор наносили на раствор 1.3 М сахарозы и центрифугировали при 237.000 g в течение 2 ч. Происходило отделение грубого ЭР (осадок) от гладкого ЭР на границе раздела 0.25-1.3 M. Эту растворимую фракцию разводили в соотношении 1:1 0.25 М сахарозой и центрифугировали при 124.000 g в течение 60 мин. Гладкий ЭР находился в осадке, который сохраняли [16].

Общие вопросы
Как изолировать хлоропласты из тканей растений?

Размешать гомогенат ткани растения в изотонической среде (0.35 моль/л хлорида натрия или 0.4 моль раствора сахарозы/л), чтобы свести к минимуму любые повреждения хлоропластов. Центрифугируют гомогенат при 1000 оборотах в течение 2 мин, чтобы удалить остатки ткани и оставшиеся клетки. Затем центрифугируют при 3000 оборотах в течение 5 мин для получения осадка хлоропласта. Центрифугирование должно проводиться при 0~5°C.

Могут ли изолированные митохондрии поддерживать физиологическую активность и функции?

Да. Центробежная сила не повреждает митохондриальную структуру. К тому же буфер для центрифугирования оказывает защитную роль на митохондрии.

Есть ли модифицированный протокол для внутриклеточного фракционирования мышечной ткани или клеток?

Простой и в материально-техническом плане недорогой протокол был опубликован для этих целей [18].

Ссылки
  1. Mendez J, Stillman B. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol Cell Biol. 2000;20:8602-12 pubmed
  2. Lossaint G, Besnard E, Fisher D, Piette J, Dulic V. Chk1 is dispensable for G2 arrest in response to sustained DNA damage when the ATM/p53/p21 pathway is functional. Oncogene. 2011;30:4261-74 pubmed publisher
  3. Attardi G, Ching E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods Enzymol. 1979;56:66-79 pubmed
  4. Smith J, Marelli M, Christmas R, Vizeacoumar F, Dilworth D, Ideker T, et al. Transcriptome profiling to identify genes involved in peroxisome assembly and function. J Cell Biol. 2002;158:259-71 pubmed
  5. Graham J. Isolation of lysosomes from tissues and cells by differential and density gradient centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. 2001;0:Unit 3.6 pubmed
  6. Basrur V, Yang F, Kushimoto T, Higashimoto Y, Yasumoto K, Valencia J, et al. Proteomic analysis of early melanosomes: identification of novel melanosomal proteins. J Proteome Res. 2003;2:69-79 pubmed
  7. Kushimoto T, Basrur V, Valencia J, Matsunaga J, Vieira W, Ferrans V, et al. A model for melanosome biogenesis based on the purification and analysis of early melanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:10698-703 pubmed
  8. Welton J, Khanna S, Giles P, Brennan P, Brewis I, Staffurth J, et al. Proteomics analysis of bladder cancer exosomes. Mol Cell Proteomics. 2010;9:1324-38 pubmed publisher
  9. Hogan M, Manganelli L, Woollard J, Masyuk A, Masyuk T, Tammachote R, et al. Characterization of PKD protein-positive exosome-like vesicles. J Am Soc Nephrol. 2009;20:278-88 pubmed publisher
  10. Shechter D, Dormann H, Allis C, Hake S. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2007;2:1445-57 pubmed
  11. Chen X, Andrews P, Wang Y. Quantitative analysis of liver Golgi proteome in the cell cycle. Methods Mol Biol. 2012;909:125-40 pubmed publisher
  12. Andersen J, Wilkinson C, Mayor T, Mortensen P, Nigg E, Mann M. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 2003;426:570-4 pubmed
  13. Moritz M, Braunfeld M, Fung J, Sedat J, Alberts B, Agard D. Three-dimensional structural characterization of centrosomes from early Drosophila embryos. J Cell Biol. 1995;130:1149-59 pubmed
  14. Wang Y, Ding S, Wang W, Yang F, Jacobs J, Camp D, et al. Methods for pseudopodia purification and proteomic analysis. Sci STKE. 2007;2007:pl4 pubmed
  15. Parisis N, Metodieva G, Metodiev M. Pseudopodial and β-arrestin-interacting proteomes from migrating breast cancer cells upon PAR2 activation. J Proteomics. 2013;80:91-106 pubmed publisher
  16. Song Y, Hao Y, Sun A, Li T, Li W, Guo L, et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 2006;6:5269-77 pubmed
  17. Nycodenz® - Density Gradient Media. Available from: www.progen.de/en/nycodenz.html
  18. Dimauro I, Pearson T, Caporossi D, Jackson M. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 2012;5:513 pubmed publisher
ISSN : 2329-5139