Экспрессия рекомбинантных белков: системы вектор-носитель
  1. Neil Broadway Ph. D.
    n dot broadway at mac dot com
    Berkhamsted, Hertfordshire, United Kingdom
Перевод
  1. Константин Якимчук Ph. D.
    Konstantin dot Yakimchuk at ki dot se
    Каролинский институт, Швеция
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.2.123
Дата
последнего обновления : 2013-11-17; оригинальная версия : 2012-06-18
Цитировать как
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2012;2:123

Данная статья представляет собой обзор наиболее часто используемых систем вектор-носитель для экспрессии белков, основанный на базе данных PDB содержащей информацию об экспрессии белка из более чем 30000 публикаций и Labome обзор 424 случайно выбранных публикаций.

Примечание: раздел об экспрессии токсичных белков был добавлен в конце этой статьи 9 сентября 2013 года.

Основные характеристики различных систем экспресии белков

Преимущества, недостатки и потенциальных применения некоторых обычно используемых рекомбинантных экспрессионных систем приведены в таблице 1. В ряде публикаций содержится подробная информация об этих системах: Escherchia coli [1] [2] [3] [4] [5] [6]; Saccharomyces cerevisiae [7] [4] [8] [9]; Pichia pastoris [10] [11] [5] [8] [9]; бакуловирус / клетки насекомых [1] [12] [5] [13]; линии клеток млекопитающих [5]; и безклеточных/in vitro белковых систем [14].

Экспрессионная системаПреимуществаНедостаткиПриложенияПроизводители
Escherichia coli
  • Потенциально очень высокие уровни экспрессии
  • Низкая стоимость
  • Простые условия культуры
  • Быстрый рост
  • Можно измерять
  • Простое преобразование протоколов
  • Многие параметры могут быть изменены, чтобы оптимизировать экспрессию
  • Неэффективное формирование дисульфидных связей
  • Возможное нарушение формирования белков в цитоплазме (включая бактериальные белки)
  • включая конформацию
  • Рефолдинг in vitro неэффективен, может свести на нет преимущества
  • Кодоны отличаются от эукариотических
  • Минимальные пост-трансляционные модификации
  • Свободна от эндотоксина
  • Созданные инженерные штаммы могут помочь облегчить проблемы с дисульфидными связями (Shuffle и Origami) и кодоном смещения (Rossetta и CodonPlus RIL / RP)
  • Очищенный белок (структура, энзимология, разработка лекарственных препаратов)
  • Белковая терапия
  • Invitrogen / Life Technologies
  • EMD Millipore
  • New England Biolabs
  • Promega
  • Clontech
  • Avidis
Saccharomyces cerevisiae
  • Хорошие уровни экспрессии
  • Возможность выбора между секретируемой и клеточной экспрессией
  • Низкая стоимость
  • Простые условия культуры
  • Можно измерять
  • Способность выполнять большинство эукариотических пост-трансляционных модификаций
  • Эффективная укладка белков
  • Свободны от эндотоксинов
  • Вероятно более низкая экспрессия, чем с Pichia pastoris
  • Секреция вероятно ниже, чем при Pichia pastoris
  • Гликозилирование различно в разных клетках млекопитающих
  • Тенденция к гипергликозилированию белков
  • N-гликановые структуры считаются аллергенными
  • Очищенный белок (структура, энзимология, разработка лекарственных препаратов)
  • Белковая терапия
  • Invitrogen/Life Technologies
Pichia pastoris
  • Высокие уровни экспрессии
  • Низкая стоимость
  • Простые условия культивирования
  • Относительно быстрый рост
  • Можно измерять
  • Возможность выбора между секретируемой или внутриклеточной экспрессией
  • Секреция белка эффективна и позволяет простую очистку
  • Широкие пост-трансляционные модификации белков
  • Эффективная укладка белков
  • N-гликозилирование больше похоже на гликозилирование у высших эукариот, чем у Saccharomyces cerevisiae
  • Свободна от эндотоксинов
  • При использовании метанола в качестве индуктора следует учитывать правила техники безрпасности по обращению с легко воспламеняющимися веществами
  • Гликозилирование еще различно в отношении клеток млекопитающих
  • Очищенный белок (структура, энзимология, разработка лекарственных препаратов)
  • Белковая терапия
  • Invitrogen/Life Technologies
Бакуловирус-инфицированные клетки насекомых
  • Хорошие уровни экспрессии (особенно для внутриклеточных белков)
  • Относительно быстрый рост
  • Эффективная укладка белков
  • Умеренный масштаб измерения
  • Широкая пост-трансляционная модификация белков
  • Гликозилирование как в клетках млекопитающих
  • Относительно легкое ферментативное гликозилирование белков (хорошо для определения структуры)
  • Свободны от эндотоксинов
  • Дорогая культуральная среда
  • Большие объемы вируса, необходимые на расширение исследований
  • Неэффективная обработка про-пептидов в секреторном пути
  • Гликозилирование еще различно в отношении клеток млекопитающих
  • Вирусная инфекция приводит к лизису клеток и возможному ухудшению свойств экспрессируемых белков
  • Очищенный белок (структура, энзимология, разработка лекарственных препаратов)
  • Белковая терапия
  • Invitrogen/Life Technologies
  • Oxford Expression Technologies
  • BD Biosciences
  • Clontech
Клетки млекопитающих
  • Хороший уровень экспрессии
  • Умеренный масштаб измерения
  • Суспензионно-адаптированные клетки удобны для исследования
  • Эффективная укладка белков
  • Хорошо подходит для секретируемых белков
  • Все пост-трансляционные модификации
  • Свободны от эндотоксинов
  • Дорогая культуральная среда
  • Сложные требования для роста
  • Очищенный белок (структура, энзимология, лекарственные препараты)
  • Белковая терапия
  • Клеточные исследования
  • Invitrogen/Life Technologies
  • EMD Millipore
  • Promega
  • Stratagene
Временная экспрессия
  • Быстрая доставка к белку
  • Реагенты для трансфекции могут быть дороги
  • Большое количество плазмидной ДНК для исследований
Стабильные клеточные линии
  • Можно сохранять белок-продуцирующие клеточные линии
  • Медленная (месяцы) доставка белка - особенно, если использовать клональный отбор
  • Потенциальная потеря экспрессии при пассаже
BacMam-опосредованная переходная трансдукция
  • Быстрая доставка к белку
  • Масштабность
  • Нет необходимости для очистки больших количеств ДНК плазмид
  • Нелитическая (бакуловирус / клетки насекомых)
  • ффективность трансдукции многих первичных типов клеток человека
  • Значительное количество вируса, необходимое для исследований
Бесклеточная продукция белка
  • Быстрая доставка к белку
  • E. coli, зародыши пшеницы, клетки насекомых и млекопитающих коммерчески доступны
  • Масштабность
  • Условиями синтеза белка можно манипулировать
  • Может легко включать не-аминокислот
  • Можно использовать продукты ПЦР в качестве матрицы-поддаются простым методам
  • Ограниченные пост-трансляционные модификации в отсутствие микросом поджелудочной железы собак
  • Дорогостоящая система
  • Очищенный белок (структура, энзимология, лекарственные препараты)
  • Клонирование экспрессии in vitro [15] [14]
  • Изотопное мечение белков для ЯМР [16] [17]
  • Включение неприродных аминокислот [18]
  • Invitrogen/Life Technologies
  • Promega
  • New England Biolabs
Таблица 1. Основные характеристики некоторых наиболее часто используемых систем экспрессии.

В таблице 1 приведены основные свойства этих систем экспрессии. Исследователи активно работают над улучшением этих фундаментальных техник (см. [19] для недавнего обзора). Несколько штаммов E. coli, которые предназначены для преодоления проблем кодона (Rossetta, CodonPlus РИЛ/RP), неэффективного образования дисульфидной связи (SHuffle, Origami, [20] ) и нарушенной экспрессии мембранных белков (C41 и C43) теперь коммерчески доступны. Кроме того, экспрессионные векторы E. coli использованием тегов-маркеров, таких как SUMO, белок, связывающий мальтозу (Maltose Binding Protein) и тиоредоксин, предназначенные для стимуляции растворимой экспрессии также являются коммерчески доступными. Предварительная экспрессия сульфгидрильной оксидазы может значительно способствовать образованию дисульфидной связи [21]. Эти подходы работают очень хорошо для некоторых белков, но для других по-прежнему не представляется возможным получить растворимую, функциональную рекомбинантную экспрессию в E. coli [22] [20]. Штаммы E. coli были даже разработаны для N- гликозилирования белка, хотя эффективность этого метода низка [23] [19]. Кроме того, разрабатываются подходы для экспрессии белков с более высоким гликозилированием как у млекопитающих в системах бакуловирус/клетка насекомого, что, следовательно, позволяет расширить полезность этих методов [24]. Были также разработаны бакуловирусные системы, которые содействуют усилению секреции белка [19].

Ключевая проблема, стоящая перед исследователем, заключается в том, что всё ещё невозможно предсказать, какая экспрессионная система будет работать лучше для того или иного белка и конкретного метода использования. Универсально применимой системы экспрессии еще не разработано [25]. При выборе системы экспрессии исследователь должен учитывать фундаментальные свойства каждой системы, их плюсы и минусы, и представлять как ограничения этой системы могут быть преодолены. Решения должны основываться на знании экспрессии белковой мишени/группы белков и методов использования рекомбинантного белка. Если позволяют средства, может быть разумным исследовать две (или более) систем экспрессии параллельно.

Несмотря на отсутствие пост-трансляционных модификаций и необходимость удаления эндотоксина из белков, экспрессированных Escherichia coli перед их использованием in vivo, система, основанная на Escherichia coli оказалась популярной для экспрессии рекомбинантных фармацевтических препаратов. В 2009 году 29,8% биофармацевтических препаратов рекомбинантного белка, которые были одобрены FDA/EMEA, были произведены в Escherichia coli. Saccharomyces cerevisiae (18,5%) и клетки млекопитающих (39%) были также популярны для получения рекомбинантных белков биофармацевтических препаратов [4].

Интересно, что одно направление в структурной геномике, инициатива по RIKEN структурной геномике (RIKEN Structural Genomics Initiative) в Японии, было сосредоточено на использовании бесклеточной методики (in vitro транскрипция/ трансляция) для создания белков при определении структуры [26] [3], что свидетельствует о синтетических возможностях современных бесклеточных систем экспрессии белка.

Ключевые аспекты экспрессии белка для структурной биологии были недавно рассмотрены в специальном издании Current Opinion in Structural Biology [Curr Opin Struct Biol (2013) 23 (3), 1- 416 New constructs and expression of proteins]. Эта статья фокусируется на наиболее часто используемых вектор–носитель экспрессионных системах. Эти системы могут быть первым пунктом при планировании экспрессии рекомбинантного белка. Тем не менее, следует отметить, что существуют и другие системы экспрессии.

Они могут представлять интерес для исследователей, имеющих опыт экспрессии белка, или в тех случаях, когда основные системы экспрессии не отвечают потребностям конкретного исследования. В качестве примера, были описаны следующие микробные/растительные системы клетки-хозяина: дрожжи (Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces [8] ); бактерии (Baccillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis и Caulobacter crescentis [2], Corynebacterium [27], гипертермофильные Sulfolobus islandicus [28] а также водоросли. Недавний обзор альтернативных/менее распространенных систем зкспрессии, используемых в структурной биологии, см [29].

Следующие вирусные векторы экспрессии доступны для экспрессии рекомбинантного белка в клетках млекопитающих: Semliki Forest вирус [30]; лентивирус [31]; и аденовирус [32]. Semliki Forest вирус хорошо себя зарекомендовал в экспрессии мембранных белков для открытия новых лекарств и структурной геномики [30]. Лентивирусные и аденовирусные векторы представляют в настоящее время большой интерес в области генной терапии [33] [34]. Имеется также значительный интерес в экспрессии терапевтических рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных [35].

Наиболее популярные носители и векторы экспрессии во Всемирной Белковой Базе Данных (Worldwide Protein Data Bank)
Всемирная Белковая База Данных

Всемирная Белковая База Данных (Worldwide Protein Data Bank) (wwPDB: http://www.wwpdb.org/) является международным сотрудничеством четырех организаций: RCSB PDB (USA: http://www.rcsb.org/); MSD-EBI (Europe: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/); PDBj (Japan: http://www.pdbj.org/); и BMRB (США). WwPDB является хранилищем высокомолекулярных структурных данных, и его "миссия состоит в том, чтобы поддерживать единый архив PDB высокомолекулярных структурных данных, свободный и публично доступный для мирового сообщества" [36] [37]. По состоянию на 20 июня 2012 года, база данных включала 82499 соединений. Подавляющим большинством соединений в wwPDB являются белки (рис. 1).

Экспрессия рекомбинантных белков: системы вектор-носитель Figure 1
Figure 1. wwPDB структуры типа полимера. Данные из PBD сайта от 20 июня 2012 года. Примечание: 96,1% от 3854 смешанных полимеров представляют собой смеси белков и нуклеиновых кислот.
Источник рекомбинантно-экспрессированных генов

Белки в wwPDB в основном экспрессировались рекомбинантно, с использованием специфичных векторов и носителей экспрессии. С помощью Рэйчел Крамер Грин, PhD, RCSB PDB, Labome скачал файл данных, связанных с выражением систем, используемых для производства белков для PDB структур на 13 марта 2012 года. Этот файл содержит в общей сложности 197348 данных. Существуют различные PDB 75015 данные и 196595 различных комбинаций PDB ID и связей. Из 197348 данных, 162432 связаны с публикациями, и в общей сложности имеется 32449 различных публикаций (PMID). 10 наиболее популярных организмов на основе данных wwPDB перечислены в таблице 2.

Источник геновСпецифичный номер wwPDB Общее кол-во публикацийСпецифичный PMID
Homo sapiens17832 363278115
Escherichia coli 5480 16033 2660
Mus musculus 3158 6585 1602
Saccharomyces cerevisiae 2032 6392 1107
Bos taurus 1886 4452 904
Rattus norvegicus 1596 3357 845
Thermus thermophilus 1176 7163 380
Mycobacterium tuberculosis 943 2720 408
Bacillus subtilis 920 2217 398
Gallus gallus 836 1742 399
Таблица 2. wwPDB структуры и соответствующие публикации по источникам экспрессии генов.

Тот факт, что Homo sapiens является наиболее распространенным источником генов для экспрессии, отражает огромное желание научного сообщества понять данные генома человека на функциональном (белковом) уровне.

Носитель и вектор экспрессии

Большинство публикаций по wwPDB (21850 из 32449 публикаций (67,3%)) сообщает об использовании Escherichia coli в качестве носителя экспрессии. В таблице 3 перечислены 5 наиболее употребляемых носителей экспрессии верхней 2 или 3 наиболее употребляемых векторов экспрессии для каждого из этих организмов-хозяев (носителей).

Носитель экспрессииПубликации по носителям экспрессииНаиболее употребляемые векторы экспрессии Публикации по плазмидам
Escherichia coli 21850
pET28 (Novagen/EMD Millipore)1694
pET15 (Novagen/EMD Millipore)1006
pET11 (Novagen/EMD Millipore)795
Spodoptera frugiperda862
pFastBac (Invitrogen/Life Tech)139
pVL1392/3 (BD Bioscience)39
pAcGP67 (BD Bioscience)27
Pichia pastoris375
pPIC (Invitrogen/Life Tech)159
pHIL (Invitrogen/Life Tech)19
Cricetulus griseus (CHO)269
pEE series22
pcDNA3/3.1 (EMD Millipore)14
Saccharomyces cerevisiae238
YEp19
pERI860212
Таблица 3.Представлены 5 наиболее часто используемых носителей экспрессии и векторов экспрессии по публикациям, основанным на данных wwPDB
Широко используемые носители экспрессии в данных wwPDB

Стоит отметить, что Escherichia coli является наиболее распространенным носителем экспрессии в wwPDB наборе данных с очень значительным перевесом.

Escherichia coli является грамотрицательной, палочковидной бактерией. Она представляет собой один из ключевых модельных организмов в научных исследованиях и была широко использована в научных и промышленных разработках. Следует отметить, что липополисахариды в наружной мембране являются источником эндотоксинов, которые могут вызывать тяжелую воспалительную реакцию в клеточной и in vivo экспериментальных моделях.

Spodoptera frugiperdacells используется для экспрессии белка в клеточных линиях (Sf9 и Sf21), полученных из тканей яичников травяной совки.

Pichia pastoris преставляют собой респираторные метилотрофные дрожжевые грибки, которые могут использовать метанол в качестве единственного источника углерода и энергии.

Клеточные линии Cricetulus griseus получены из клеток яичников китайского хомячка (СНО). Эта широко используемая клеточная линия может быть адаптирована к суспензионному росту. Большинство рекомбинантных антител получают используя клеточные линии CHO.

Saccharomyces cerevisiae являются ферментативными дрожжами, хорошо изученными генетически. Это были первые дрожжи, регулярно использованные для экспрессии рекомбинантного белка.

Широко используемые векторы экспрессии в данных wwPDB

Для каждого хозяина экспрессии 2 или 3 наиболее часто упоминаемых вектора экспрессии составляют лишь относительно небольшую долю от общего числа публикаций (табл. 3). Это отражает широкий спектр различных векторов экспрессии, которые были использованы для каждого хозяина экспрессии.

На рисунках 2 и 3 показаны плазмидные карты для pET28 и pcDNA3.3 (последняя версия pcDNA3) соответственно. Эти плазмиды являются прототипными экспрессирующими векторами для E. coli и в клетках млекопитающих.

В pET векторах промотор РНК-полимеразы Т7 запускает экспрессию рекомбинантного гена. PET28 плазмида кодирует N-концевые участки расщепления His-tag/thrombin site/T7-tag и дополнительную С-концевую His-Tag последовательность. Эти векторы используются с лямбда DE3 лизогенными штаммами E. coli. В этих штаммах экспрессия геномной копии РНК-полимеразы Т7 находится под контролем lac репрессора. Экспрессия рекомбинантного белка индуцируется добавлением изопропил-b-D-тио-галактозида (IPTG) в культуральную среду. Интересно, что векторы, в которых экспрессия индуцируется другими молекулами (например, арабинозой) не представлены в базе данных wwPDB.

Экспрессия рекомбинантных белков: системы вектор-носитель Figure 2
Figure 2. Плазмидная карта pET28. Изображения pET28 предоставлены с разрешения EMD Millipore Corporation.

В серии плазмид pcDNA3 экспрессия регулируется ранним промотором цитомегаловируса человека (CMV). Это сильный промотор, постоянно активный в клетках млекопитающих. pcDNA3 - это оригинальная версия pcDNA3 серии векторов, не являющийся коммерчески доступным. Последней разработкой этой серии векторов является pcDNA3.3. Следует отметить, что pcDNA3.1 был также определен как один из наиболее часто используемых экспрессионных векторов млекопитающих по результатам анализа случайно выбранных публикаций (см. ниже).

Экспрессия рекомбинантных белков: системы вектор-носитель Figure 3
Figure 3. Плазмидная карта pcDNA3.3. Схемы pcDNA3.3 предоставлены с разрешения корпорации Life Technologies.

Все наиболее часто используемые бакуловирус/клетка насекомых векторы используют сильный промотор полиэдрина для управления постоянной экспрессии рекомбинантного белка.

Плазмиды (векторы переноса бакуловируса) сами по себе напрямую не управлют экспрессией белка. Они используются для генерирования рекомбинантного бакуловируса, содержащего выбранный ген под контролем промотора полиэдрина. pFastBac относится к более новому поколению, которое использует плазмиды сайт-специфической транспозиции для получения рекомбинантного бакуловируса. Это сокращает время, затрачиваемое на создание рекомбинантного бакуловируса до 2 недель по сравнению с 4-6 неделями, необходимыми для плазмид старшего поколения, таких как pVL1392/3 и pAcGP67.

Оба вектора Pichia pastoris используют сильный промотер АОХ1. Экспрессия индуцируется метанолом. Несмотря на то, что Pichia pastoris является превосходной системой для производства секретируемых белков (см. ниже), два наиболее часто используемых Pichia pastoris векторов экспрессии в базе данных wwPDB предназначены для цитоплазматической экспрессии.

Плазмиды YEp Saccharomyces cerevisiae регулируют экспрессию через дрожжевой промотер GAL1. Экспрессия подавляется глюкозой и индуцируется галактозой.

Потенциальные отклонения в данных wwPDB

Данные таблицы 3 описывают носителей и векторов экспрессии, которые были специально использованы для производства белков для структурных исследований. Следовательно, этот набор данных смещён в сторону тех векторов/носителей экспрессии, которые способны генерировать большие количества очищенных белков, необходимых для 3-мерных структурных исследований. Неспособность E. coli гликозилировать белки и относительная легкость, с которой N-гликозилирование в клетках насекомых может быть удалено ферментативно (см. таблицу 1) также могут вносить вклад в частое использовании этих систем в базе данных wwPDB. Негликозилированные белки обычно являются предпочтительными для структурных исследований, если только молекулы сахара не являются существенными для функции. Для других приложений (например, ферментных тестов, клеточных анализов, производства антигена для получения антител поколения, сверхэкспрессии для изучения клеточных функций или локализации), экспрессия и очистка значительных количеств белка не являются необходимыми. Действительно, для клеточных исследований очистка рекомбинантных белков вряд ли будет применяться. Тем не менее, данные по векторам/носителям экспрессии полученные из wwPDB, являются чрезвычайно ценным ресурсом. Эти данные могут помочь развитию исследований по экспрессии белка для многих приложений.

Популярные векторы экспрессии из исследованных публикаций

Чтобы избежать возможных отклонений в данных wwPDB, Labome исследовал 424 случайно выбранных публикации, описывающих эти плазмиды. Две наиболее часто используемые группы векторов экспрессии показаны в таблице 4.

Векторы экспрессииОтдельные PMIDНоситель вектора экспрессииНаиболее часто используемые варианты (кол-во публикаций)
pcDNA3.1 (Invitrogen/Life Tech)59Mammalian cell linespcDNA 3.1 V5, His (4)
pcDNA 3.1 His (3)
pEGFP (Clontech)28Mammalian cell linespEGFP-C1 (11)
pEGFP-N1 (8)
Таблица 4. Наиболее часто используемые векторы экспрессии на анализа обзора 424 случайно выбранных публикаций

Как было замечено при анализе данных wwPDB, наиболее часто упоминаемые векторы экспрессии описаны в небольшой доле от общего числа публикаций. Опять же, это отражает разнообразие векторов экспрессии, которые исследователи используют для любого носителя экспрессии. pcDNA3.1 индуцирует экспрессию в клетках млекопитающих с помощью постоянного промотора CMV (см. выше).Также, pEGFP является экспрессирующим вектором в клетках млекопитающих, в котором экспрессия индуцируется постоянно с помощью промотора CMV. Активированный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) экспрессируется либо в виде N-концевого (pEGFP-C1) или С-концевого (pEGFP-N1) слияния с белком выбора. Эти pEGFP векторы могут быть использованы для изучения внутриклеточной локализации или трафика белков путем мониторинга флуоресценции EGFP [38] [39].

Следует отметить, что наиболее часто используемые векторы экспрессии в клетках млекопитающих, и в публикациях обзора и множестве wwPDB данных, индуцируют постоянную экспрессию. И это несмотря на коммерческую доступность индуцибельных векторов экспрессии в клетках млекопитающих, таких как T-RexTM системы и PF12 RM системы FlexiTM.

Хотя и не высоко отмеченная в академических публикациях, система BacMam оказалась популярной в фармацевтической промышленности для экспрессии белков как для клеточных исследований, так и для очистки [40] [41] [42] и в настоящее время коммерчески доступна. BacMam использует модифицированный бакуловирус, в котором обычный промотор заменён на активный в клетках млекопитающих промотер CMV. Вирус BacMam индуцирует нерепликативную, нелитическую экспресию в широком диапазоне типов клеток млекопитающих.

Типичный процесс экспрессии белка

На рисунке 4 показаны два типичных рабочих процесса экспрессии белка. Один из них приводит к образованию очищенного белка. Другой приводит к генерации клеточной линии, экспрессирующейрекомбинантный белок. В реальной жизни эти рабочие процессы могут перекрываться, если, например, стабильная линия клеток млекопитающих должна быть использована в качестве исходного материала, который подвергается очистке для выделения рекомбинантного белка.

Экспрессия рекомбинантных белков: системы вектор-носитель Figure 4
Figure 4. Типичные процессы экспрессии белка.
Экспрессия токсичных белков

Экспрессия рекомбинантных белков, являющихся токсичными для клеток-носителей, в которых они экспрессируются, часто является проблематичной.

Существует несколько доступных технологий для преодоления этой проблемы. Исследователь обычно должен эмпирически принять потенциальное решение которой лучше всего подходит для их конкретного белка.

Предшествующие публикации, целевые знания и практический опыт в отношении белка-мишени могут быть использованы для того, чтобы руководствоваться при выборе стратегии.

Escherichia coli (кишечная палочка)

Ключевым вопросом в связи с экспрессией в E. coli является экспрессия токсичных белков до индукции. Это приводит к потере или перегруппировке плазмиды, плохому росту клеток и низкой экспрессии белка [43] [http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/decreasing_protein_toxicity/].

Ряд подходов были разработаны для решения проблемы экспрессии токсичных белков в E. coli.

  • Жёстко регулируемые (стабильные) системы экспрессии, такие как pBAD системы, использующие araBAD промотер (Invitrogen / Life Sciences), могут быть использованы для того, чтобы минимизировать базальную экспрессию [43].
  • С плазмидами на основе Т7 промотера, предварительная индукция экспрессии может быть уменьшена за счет использования pLysS/pLysE/pLysY носителей-клеток, экспрессирующих лизоцим Т7, который ингибирует Т7РНК-полимеразу и, таким образом, уменьшает активность промотера до индукции IPTG. Аналогичным образом, глюкоза может быть использована для подавления активности промотера до индукции с помощью IPTG [43].
  • Система pETcocoTM (EMD Millipore) позволяет поддерживать число копий плазмиды на очень низком уровне во время роста клеток, таким образом минимизируя основную экспрессию и максимизируя стабильность плазмиды до индукции. Число копий плазмиды заметно активируется и экспрессия генов-мишени индуцируется IPTG [43].
  • Другим подходом является использование штаммов-носителей, таких как C41 (DE3) и C43 (DE3), эмпирически отбираемых по их способности экспрессировать токсичные белки более эффективно, чем родительский штамм BL21 (DE3) (Avidis, Lucigen) [43].
  • Эмпирический скрининг тегов слияния, таких, как белок, связывающий мальтозу, GST, тиоредоксин или SUMO позволяет идентифицировать партнера по слиянию, который преодолевает токсичность белка-мишени (Invitrogen/Life Sciences, New England Biolabs , LifeSensors ) [43].
  • Направленная экспрессия в периплазме может потенциально преодолеть токсичность, связанную с цитозольным аккумулированием [43].
  • Культура Batch-fed также может быть полезным подходом к экспрессии токсичных белков [44].
Экспрессия в клетках млекопитающих

Многие системы экспрессии в клетках млекопитающих используют постоянно активный CMV промотер. Очевидно, что это проблематично для экспрессии белков, которые являются токсичными для клеток-носителей. Однако исследователи часто желают изучить клеточные функции таких белков или экспрессировать и очистить эти белки, несущие полный набор посттрансляционных модификаций клеток млекопитающих.

Ряд индуцибельных системы экспрессии млекопитающих, использующих сильный промотер CMV, в настоящее время коммерчески доступны. В этих системах экспрессия индуцируется тетрациклином (T- RexTM Invitrogen/Life Sciences, Тет- Clontech в сетях 3G), экдизоном (Agilent Technologies/Stratagene) и IPTG (pTUNE Origene). Эти системы способствуют росту достаточного количества клеток до индукции белка-мишени .

Использование различных систем экспрессии

Если одна конкретная система экспрессии не работает, может быть выгодно переключиться на другую систему (например, дрожжи, клетки насекомых, бактерий, млекопитающих), если другие соображения позволяют (например, использование посттрансляционных модификаций). Белок, токсичный в одной системе, возможно, не будет токсичным в другой [43].

Внеклеточная экспрессия белка

Если требуется сравнительно небольшое количество (очищенного) белка, то внеклеточная продукция белка является привлекательным вариантом, чтобы обойти проблемы клеточной токсичности [43].

Ссылки
  1. Hunt I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr Purif. 2005;40:1-22 PMID 15721767
  2. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;72:211-22 PMID 16791589
  3. Gräslund S, Nordlund P, Weigelt J, Hallberg B, Bray J, Gileadi O, et al. Protein production and purification. Nat Methods. 2008;5:135-46 PMID 18235434 CrossRef
  4. Ferrer-Miralles N, Domingo-Espín J, Corchero J, Vazquez E, Villaverde A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microb Cell Fact. 2009;8:17 PMID 19317892
  5. Brondyk W. Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein. Methods Enzymol. 2009;463:131-47 PMID 19892171 CrossRef
  6. Gopal G, Kumar A. Strategies for the Production of Recombinant Protein in Escherichia coli. Protein J. 2013;32:419-25 PMID 23897421 CrossRef
  7. Holz C, Hesse O, Bolotina N, Stahl U, Lang C. A micro-scale process for high-throughput expression of cDNAs in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif. 2002;25:372-8 PMID 12182816
  8. Celik E, Calik P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol Adv. 2012;30:1108-18 PMID 21964262 CrossRef
  9. Mattanovich D, Branduardi P, Dato L, Gasser B, Sauer M, Porro D. Recombinant protein production in yeasts. Methods Mol Biol. 2012;824:329-58 PMID 22160907 CrossRef
  10. Macauley-Patrick S, Fazenda M, McNeil B, Harvey L. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 2005;22:249-70 PMID 15704221
  11. Gurkan C, Ellar D. Recombinant production of bacterial toxins and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Microb Cell Fact. 2005;4:33 PMID 16336647
  12. Hu Y. Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta Pharmacol Sin. 2005;26:405-16 PMID 15780188
  13. Jarvis D. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 2009;463:191-222 PMID 19892174 CrossRef
  14. Jackson A, Boutell J, Cooley N, He M. Cell-free protein synthesis for proteomics. Brief Funct Genomic Proteomic. 2004;2:308-19 PMID 15163366
  15. King R, Lustig K, Stukenberg P, McGarry T, Kirschner M. Expression cloning in the test tube. Science. 1997;277:973-4 PMID 9281074
  16. Keppetipola S, Kudlicki W, Nguyen B, Meng X, Donovan K, Shaka A. From gene to HSQC in under five hours: high-throughput NMR proteomics. J Am Chem Soc. 2006;128:4508-9 PMID 16594652
  17. Kohno T, Endo Y. Production of protein for nuclear magnetic resonance study using the wheat germ cell-free system. Methods Mol Biol. 2007;375:257-72 PMID 17634606
  18. Noren C, Anthony-Cahill S, Griffith M, Schultz P. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 1989;244:182-8 PMID 2649980
  19. Assenberg R, Wan P, Geisse S, Mayr L. Advances in recombinant protein expression for use in pharmaceutical research. Curr Opin Struct Biol. 2013;23:393-402 PMID 23731801 CrossRef
  20. de Marco A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 2012;11:129 PMID 22978724
  21. Nguyen V, Hatahet F, Salo K, Enlund E, Zhang C, Ruddock L. Pre-expression of a sulfhydryl oxidase significantly increases the yields of eukaryotic disulfide bond containing proteins expressed in the cytoplasm of E.coli. Microb Cell Fact. 2011;10:1 PMID 21211066 CrossRef
  22. de Marco A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2009;8:26 PMID 19442264
  23. Valderrama-Rincon J, Fisher A, Merritt J, Fan Y, Reading C, Chhiba K, et al. An engineered eukaryotic protein glycosylation pathway in Escherichia coli. Nat Chem Biol. 2012;8:434-6 PMID 22446837 CrossRef
  24. Palmberger D, Wilson I, Berger I, Grabherr R, Rendic D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS ONE. 2012;7:e34226 PMID 22485160 CrossRef
  25. Sørensen H. Towards universal systems for recombinant gene expression. Microb Cell Fact. 2010;9:27 PMID 20433754 CrossRef
  26. Yokoyama S, Hirota H, Kigawa T, Yabuki T, Shirouzu M, Terada T, et al. Structural genomics projects in Japan. Nat Struct Biol. 2000;7:943-5 PMID 11103994
  27. Sundaram R, Hurwitz I, Matthews S, Hoy E, Kurapati S, Crawford C, et al. Expression of a functional single-chain antibody via Corynebacterium pseudodiphtheriticum. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008;27:617-22 PMID 18322717 CrossRef
  28. Peng N, Deng L, Mei Y, Jiang D, Hu Y, Awayez M, et al. A synthetic arabinose-inducible promoter confers high levels of recombinant protein expression in hyperthermophilic archaeon Sulfolobus islandicus. Appl Environ Microbiol. 2012;78:5630-7 PMID 22660711 CrossRef
  29. Fernandez F, Vega M. Technologies to keep an eye on: alternative hosts for protein production in structural biology. Curr Opin Struct Biol. 2013;23:365-73 PMID 23481468 CrossRef
  30. Lundstrom K. Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors. Methods Mol Biol. 2010;601:149-63 PMID 20099145 CrossRef
  31. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel R, Nguyen M, Trono D, et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 1998;72:8463-71 PMID 9765382
  32. Bett A, Haddara W, Prevec L, Graham F. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:8802-6 PMID 8090727
  33. Sakuma T, Barry M, Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J. 2012;443:603-18 PMID 22507128 CrossRef
  34. Yao X, Nakagawa S, Gao J. Current targeting strategies for adenovirus vectors in cancer gene therapy. Curr Cancer Drug Targets. 2011;11:810-25 PMID 21762081
  35. Bosze Z, Baranyi M, Whitelaw C. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species. Adv Exp Med Biol. 2008;606:357-93 PMID 18183938
  36. Berman H, Henrick K, Nakamura H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol. 2003;10:980 PMID 14634627
  37. Berman H, Henrick K, Nakamura H, Markley J. The worldwide Protein Data Bank (wwPDB): ensuring a single, uniform archive of PDB data. Nucleic Acids Res. 2007;35:D301-3 PMID 17142228
  38. Broadway N, Pease R, Birdsey G, Shayeghi M, Turner N, David Saggerson E. The liver isoform of carnitine palmitoyltransferase 1 is not targeted to the endoplasmic reticulum. Biochem J. 2003;370:223-31 PMID 12401113
  39. Tamura K, Ohbayashi N, Ishibashi K, Fukuda M. Structure-function analysis of VPS9-ankyrin-repeat protein (Varp) in the trafficking of tyrosinase-related protein 1 in melanocytes. J Biol Chem. 2011;286:7507-21 PMID 21187289 CrossRef
  40. Scott M, Modha S, Rhodes A, Broadway N, Hardwicke P, Zhao H, et al. Efficient expression of secreted proteases via recombinant BacMam virus. Protein Expr Purif. 2007;52:104-16 PMID 17129735
  41. Kost T, Condreay J, Ames R, Rees S, Romanos M. Implementation of BacMam virus gene delivery technology in a drug discovery setting. Drug Discov Today. 2007;12:396-403 PMID 17467576
  42. Davenport E, Nuthulaganti P, Ames R. BacMam: versatile gene delivery technology for GPCR assays. Methods Mol Biol. 2009;552:199-211 PMID 19513651 CrossRef
  43. Saida F, Uzan M, Odaert B, Bontems F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 2006;7:47-56 PMID 16472168
  44. Khasa Y, Khushoo A, Mukherjee K. Enhancing toxic protein expression in Escherichia coli fed-batch culture using kinetic parameters: Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as a model system. J Biosci Bioeng. 2013;115:291-7 PMID 23098681 CrossRef
ISSN : 2329-5139