Выделение и очистка белков
Caroline Ritchie (caroline dot ritchie103 at gmail dot com)
Iowa State University, United States
Перевод
Aleksei Stepanenko (a dot a dot stepanenko at gmail dot com)
Laboratory of Biosynthesis of Nucleic Acids, Department of Functional Genomics, 150 Zabolotnogo Street, Kyiv 03680, Ukraine
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.2.134
Дата
последнего обновления : 2016-08-18; оригинальная версия : 2012-11-17
Цитировать как
MATER METHODS ru 2012;2:134
Абстракт

Углубленный обзор колоночной хроматографии для выделения и очистки белков.

English Abstract

An in-depth review of column chromatography for protein purification and survey result from 305 formal publications.

Очищенные белки необходимы для многих экспериментов, в том числе для структурных исследований и in vitro биохимических анализов. Белки могут быть получены из ткани или чаще всего их продуцируют в модельных организмах, таких как бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих в культуре. Выделение и очистка белков основывается на различиях в их физических свойствах. Целью очистки белка является сохранение наибольшего количества функционального белка с наименьшим количеством примесей. План очистки белка должен быть оптимизирован, чтобы завершить данный процесс с наименьшим количеством шагов.

Выделение и очистка белков Рисунок 1
Рисунок 1. Трис-буферный раствор содержит Tris основание и сопряженную кислоту. Значение pKa Tris при 25°C состовляет 8.06, указывая, что при pH = 8.06 50% молекул Tris протонированы (находятся в кислой форме) и 50% депротонированы (находятся в основной форме).

В статье рассматриваются четыре типа хроматографии на колонке, которые обычно используются при очистке белков, и обсуждаются преимущества и недостатки, и потенциальные проблемы каждого подхода. В этой статье также сообщается результат анализа 98 публикаций, выполненный Labome. Исследование указывает на то, что колоночная аффинная хроматография, главным образом, основанная на HIS, GST и FLAG тагах, и эксклюзионная хроматография являются основными методами, цитируемыми в публикациях. GE Healthcare является основным поставщиком реагентов и инструментов, используемых при очистке белков.

Разработка схемы очистки белка

Наиболее важным фактором в разработке схемы очистки белка является то, как данный белок будет использоваться после очистки. И количество, и чистота белка должны быть достаточными для экспериментального анализа. Кроме того, информация о поведении белка должны быть приняты во внимание, поскольку для последующих исследований необходим функциональный белок. Во время очистки и последующего хранения могут происходить многие процессы, которые влияют на качество белка: белок денатурирует, агрегирует, деградирует и теряет функцию. Максимизировать вероятность успешной очистки белка можно за счет как можно быстрой, тщательно спланированной схемы очистки в самых благоприятных и стабилизирующих условиях

Выделение и очистка белков Рисунок 2
Рисунок 2. Aktaprime плюс система для автоматизированного хроматографического разделения белков. От GE.
Буферный раствор

Свойства раствора, в котором находится белок на каждом этапе очистки, имеют важное значение в поддержании стабильности и функции белка. Белок должен храниться в хорошо забуференной среде, чтобы предотвратить внезапные изменения рН, которые могут необратимо повлиять на фолдинг, растворимость и функцию.

Буфер представляет собой раствор, содержащий пару кислота/основание. Диапазон рН буфера основан на его рКa, определяемом как рН, при котором 50% молекул находятся в кислотной форме и 50% находятся в основной форме (Рисунок 1). Общим правилом для буферов является то, что рН буферного раствора должен быть в пределах 1,0 рН единицы рКa, чтобы обеспечить соответствующую буферную емкость. Это гарантирует существование достаточного количества молекул как в кислотной, так и основной формах для нейтрализации раствора в случае притока H+ или OH-. Таким образом, буферы предотвращают изменения рН, которые могут негативно повлиять на стабильность белка.

Выделение и очистка белков Рисунок 3
Рисунок 3. Ni-NTA-лиганд, ковалентно присоединенный к сшитой агарозной матрице для селективной очистки меченных полигистидином белков. Гистидин может координировать Ni2+ ион путем замены молекул связанной воды (обозначены красными стрелками). Затем можно использовать имидазол или свободный гистидин, чтобы элюировать белок, благодаря их способности координировать Ni2+ ион и замещать связанный белок. От BioKe.

Хороший буфер должен обладать следующими характеристиками [1] :

  1. Растворимость в воде
  2. Химическая стабильность
  3. Высокая буферная емкость при желаемом значении рН
  4. Совместимость с аналитическими и экспериментальными методами исследования
  5. Совместимость с другими компонентами раствора

Многие компоненты могут служить в качестве биологических буферов. Наиболее часто используемые компоненты имеют близкий к нейтральному pKa и могут быть использованы при физиологическом рН. Четыре наиболее распространенных биологических буфера перечислены в Таблице 1 вместе с их диапазонами рН, при которых они могут быть использованы, а также преимущества и недостатки, которые могут повлиять на их использование в очистке белка. Как правило, эти буферы используются в концентрациях выше 25 мМ, чтобы обеспечить достаточную буферную емкость.

БуферДиапазон рНПреимущества и недостатки
Фосфат5.8-8.0
  • рН не зависит от температуры
  • Недорогой
  • Прозрачный в УФ-диапазоне
  • Не может использоваться с двухвалентными катионами
MOPS6.5-7.9
  • Не может быть автоклавирован
  • рН в некоторой степени зависит от температуры
  • Высокая буферная емкость при физиологическом рН
HEPES6.8-8.2
  • Не может быть автоклавирован
  • рН в некоторой степени зависит от температуры
  • Может образовывать радикалы при определенных условиях [2]
Трис7.5-9.0
  • рН зависит от температуры и разбавления
  • Недорогой
  • Может влиять на активность некоторых ферментов [3], [4]
  • Прозрачный в УФ-диапазоне
Таблица 1. Наиболее часто используемые биологические буферы для очистки белков. Буферы сохраняют свою буферную емкость в пределах определенного диапазона рН, и характеристики некоторых компонентов буферна могут влиять на процедуру хроматографии или анализ. Данные обобщены от Promega, Sigma-Aldrich, AppliChem, Embl.de.
Дополнительные компоненты растворов

В дополнение к соответствующей буферной системе, растворы, используемые в процессе очистки белка от лизиса до хранения, часто содержат много других компонентов, которые играют определенную роль в обеспечении чистоты белка, стабильность и функции.

Ингибиторы протеаз часто добавляют в буфер для лизиса и на ранних этапах очистки, чтобы предотвратить деградацию целевого белка эндогенными протеазами. Ингибиторы протеаз, как правило, не требуются на более поздних стадиях очистки, так как большинство или все примесные протеазы уже отделены от белка, представляющего интерес. Хелаторы металлов, такие как ЭДТА или ЭГTA, часто добавляют в буфер для хранения. Эти металлические сорбенты связываются с Mg2+ и, таким образом, предотвращают расщепление очищенного белка контаминирующими металлопротеазами. Другие компоненты также часто используются для защиты белков от повреждения и для повышения их растворимости.

ТипФункцияЧасто используемые реагенты
Восстанавливающие агентыЗащищают от окислительного повреждения
  • 2-меркаптоэтанол (BME)
  • Дитиотреитол (ДТТ)
  • Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP)
Ингибиторы протеазИнгибируют эндогенные протеазы от разрушения белков
  • Лейпептин(ингибитор сериновых и цистеиновых протеаз)
  • Пепстатин A (Ингибитор аспарагиновых протеаз)
  • PMSF(ингибитор сериновых протеаз)
Хелаторы металловИнактивируют металлопротеазы
ОсмолитыСтабилизируют структуру белка и повышают растворимость
Ионные стабилизаторыУсиливают растворимостьСоли (например, NaCl, KCl, (NH4)2SO4
Таблица 2. Дополнительные компоненты, обычно используемые в буферах для выделения с целью увеличения стабильности белков. Данные обобщены от Thermo Fisher Pierce и Embl.de.

Дополнительные компоненты следует использовать только в случае необходимости. Часто требуется метод проб и ошибок, чтобы определить конкретные дополнительные компоненты, которые будут благоприятны для конкретной схемы очистки белка.

Другие факторы, которые следует рассмотреть

Другие факторы также способствуют стабильности белка во время очистки. Наименьшее число манипуляций над белком в процессе его очистки всегда является лучшим решением. Схема очистки, которая использует минимальное количество шагов в кратчайшие сроки, обеспечивает высокий выход функционального белка. Кроме того, часто лучше всего держать белок на холоде во время очистки. Как правило, очистку проводят при 4°C, так как эта температура замедляет скорость протеолиза (в случае примесей протеаз) и способствует структурной целостности белков.

Введение в колоночную хроматографию
Оборудование для хроматографии на колонке

Сутью хроматографии на колонке является разделение большого пула белков на множество более мелких, некоторые из которых обогащены белком, представляющим интерес. Не смотря на то, что для хроматографии на колонке доступно специальное дорогое оборудование, для ее проведения требуется только основное оборудование.

Выделение и очистка белков Рисунок 4
Рисунок 4. Схема аффинной очистки с использованием протеинов A, G, или L. А. Антитела содержат несколько областей, представляющих интерес: Fc (фрагмент, константа) является одинаковым для всех белков одного и того же класса, Fv (фрагмент, переменный) дает специфичность для каждого антитела и Fab (фрагмент, антиген-связывающий), который контактирует со специфическим антигеном. В. Специфические классы антител могут быть неселективно очищены через аффинную очистку, при которой лиганд (Протеин A, G или L) конъюгирует с матрицей. C. Протеин A, G или L также может быть использован для очистки специфических белков. В этом случае антитело будет служить в качестве промежуточного лиганда, обеспечивающего селективность по отношению к своему антигену.

Основное оборудование для хроматографии на колонке:

  1. Стационарная фаза: инертная матрица используется для разделения белков, часто с присоединенной функциональной группой для усиления взаимодействия с белком. Выбор стационарной фазы и функциональной группы зависит от типа хроматографии.
  2. Колонка: цилиндрический стеклянный резервуар различной длины и диаметра. Колонку можно приобрести предварительно упакованную неподвижной фазой и готовой к использованию в автоматизированных системах хроматографии (обсуждается в части 2 настоящей статьи) или можно купить пустую колонку для самостоятельно заполнения. Различные типы колонок требуются для автоматизированной хроматографии при сравнении с самотечной хроматографией.
  3. Растворители: буферы, содержащие дополнительные компоненты, используемые для уравновешивания, промывки и элюции белков из неподвижной фазы. Различные типы хроматографии требуют различные растворители.
  4. Коллекторные пробирки: пробирки для сбора элюированных образцов. Специальные пробирки необходимы для автоматизированных коллекторов фракций; тем не менее, любая пробирка или сосуд подойдут для ручного сбора фракций.
  5. Измерение степени чистоты: подход для определения относительного количества специфического белка от общего белка в образце. Фракции, содержащие белок, представляющий интерес, должны быть определены после каждого шага, прежде чем перейти к следующему этапу в схеме очистки. Некоторые общие методы анализа чистоты будут обсуждаться в следующем разделе.
Системы для хроматографии на колонке

Колоночная хроматография может быть выполнена с помощью автоматизированных систем (Рисунок 2), в которых используется насос, чтобы заставить растворитель продвигаться по заполненной колонке с заданной скоростью, или растворитель может быть прогнан самотеком под действием гравитации. Как автоматические, так и гравитационные проточные системы могут быть соединены с автоматической системой сбора фракций. У каждой системы есть свои преимущества и недостатки. Система GE Healthcare AKTA FPLC является очень распространенным выбором [5-10].

Тип системыПреимуществаНедостатки
Автоматизированная
  • Может работать самостоятельно
  • Часто соединена с детектором оптической плотности
  • Можно программировать уравновешивание и промывочные шаги
  • Легко установить градиент для элюирования
  • Высокая воспроизводимость
  • Требуется специальное дорогостоящее оборудование
  • Максимальная скорость потока зависит от предела давления колонки
Течение под действием силы тяжести
  • Менее дорогая
  • Пользователь имеет больше контроля
  • Может вносить коррективы во время прогонки
  • Более трудоемкая
  • Течение ограничено действием силы тяжести
Таблица 3. Системы для хроматографического разделения белков. Обобщены данные от GE.
Типы колоночной хроматографии

Четыре основных типа хроматографии на колонке включают аффинную хроматографию (АХ), ионообменную хроматографию (ИОХ), гидрофобную хроматографии (ГФХ) и эксклюзионную хроматографии (ЭХ). Большинство схем очистки требуют использования более чем одного из этих типов хроматографий для получения белка необходимой чистоты для последующего анализа. Выбор наиболее подходящего метода(ов) хроматографии и порядок использования этих методов имеет важное значение для оптимизации схемы очистки белков.

Тип хроматографииРазделение белковСвязываниеЭлюирование
АффиннаяСпецифическое взаимодействиеНет конкурирующего лигандаКонкурирующий лиганд (специфическое); условия, которые разрушают белок- белковые взаимодействия (неспецифическое)
ИонообменнаяОбщий поверхностный зарядНизкая ионная силаВысокая ионная сила; увеличенный (катионный обмен) или уменьшенный (анионный обмен) рН
Гидрофобные взаимодействияГидрофобностьВысокая ионная силаНизкая ионная сила
ЭксклюзионнаяГидродинамический радиус
Таблица 4. В очистке белка используются четыре наиболее распространенных типа хроматографии на колонке.

На основе анализа последовательности белка могут быть идентифицированы уникальные характеристики, которые могли бы оказать помощь в его очистке. Могут быть определены размер и заряд белка (при определенном значении рН), также как и длинные гидрофобные последовательности.

Аффинная хроматография

Аффинная хроматография основывается на специфическом и обратимом связывании белка со связанным с матрицей лигандом. Лиганд может либо непосредственно связываться с представляющим интерес белком, либо с тагом, который ковалентно пришит к белку. Аффинная хроматография часто является наиболее надежной процедурой очистки и, как правило, используется в ранней стадии схемы очистки. В зависимости от последующего применения белка, аффинная очистка может быть единственным хроматографическим шагом, необходимым для достижения достаточной чистоты.

Выделение и очистка белков Рисунок 5
Рисунок 5. Суммарный заряд на белке зависит от рН его растворителя. При рН = ИЭТ, белок имеет нулевой результирующий заряд и, следовательно, не будет связываться с катионообменной или анионообменной стационарной фазой. Изменение рН выше или ниже ИЭТ белка приведет к появлению суммарного заряда и связыванию белка с анионообменной (pH > pI) или катионнообменной (pH < pI) неподвижной фазой.

Неподвижная фаза для аффинной хроматографии выполнена из инертной матрицы, ковалентно связанной с лигандом, который специфически связывается с белком или группой белков. Инертная матрица обычно состоит из поперечно-сшитой агарозы или полиакриламида. Белки могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии селективным или неселективным способом. В селективной аффинной хроматографии используют специфический для белка или ковалентно пришитого тага лиганд. В неселективной аффинной хроматографии лиганд связывается с группой белков со сходными связывающими способностями, например, белок A, G, L для иммуноглобулинов, гепарин для ДНК-связывающих белков и лектин для гликопротеинов.

В обоих типах аффинной хроматографии белки наносят на колонку в растворе, который способствует связыванию белка (или тага) с его лигандом. Связанный белок промывают раствором, который не нарушает специфическое взаимодействие, но приводит к нарушению каких-либо неспецифических взаимодействий между нецелевыми белками и стационарной фазой. Связанный белок элюируют буфером, содержащим конкурирующую молекулу или раствором, который разрушает все белок-белковые взаимодействия. Конкурирующие молекулы связываются с лигандом, вытесняя белок, представляющий интерес. Конкурирующие молекулы, как правило, удаляются из раствора интересующего белка либо другой хроматографической процедурой, либо путем диализа. Способы элюирования белков из неподвижной фазы путем разрушения всех белок-белковых взаимодействий включают регулирование рН или ионной силы буфера. Эти методы могут влиять на стабильность белка, и предполагается, что раствор с элюированным белком будет немедленно нейтрализован или разбавлен, чтобы минимизировать повреждение белка. Для некоторых форм аффинной хроматографии описаны альтернативные условия элюирования, чтобы максимизировать выход функционального белка [11, 12].

Очищаемый белокЛигандЭлюируется с помощью
Антитело (антиген-специфическое)Антигенный пептидСвободный пептид
Белок с полигистидиновым тагомNi2+ или Co2+Имидазол или свободный гистидин
Белок с FLAG тагомFLAG-специфические антителаFLAG пептид или низкий pH
Белок с GST тагомВосстановленный глутатионСвободный глутатион
Белок с Myc тагомMyc-специфические антителаНизкий pH
Антитело (класс-спейифическое)Белок A, G или LКрайние значения рН
ДНК-связывающий белокГепаринВысокая ионная сила
Таблица 5. Примеры селективных и неселективных форм аффинной хроматографии с функциональной группой (лигандом), используемых для специфичности и типичных условий элюирования. Данные обобщены от Thermo Fisher Pierce и GE. Смотрите ниже распространенных поставщиков различных типов колонок, данные основаны на анализе более 200 публикаций, проведенном Labome.

При конструировании плазмиды для экспрессии белка аффинные метки могут быть помещены либо с N-конца, либо с С-конца (или в редких случаях в гибкие петли белков с известными структурами) для способствования очистки. Смотрите исследование, проведенное Labome protein/protide tags, списка тагов и связанное с ними обсуждение.

Антитела часто очищают на основании высоко специфического взаимодействия, которое происходит между антителом и его антигеном (последовательность, распознаваемая антителом). Пептид, содержащий антиген, может быть соединен с матрицей для специфического связывания с антителом. Понижение рН буфера для элюции приводит к нарушению взаимодействия антитело-пептид и высвобождения связанного антитела. Этот метод часто используется в коммерческих целях для выделения антител из сыворотки.

Выделение и очистка белков Рисунок 6
Рисунок 6. Ионообменная хроматография. Белки связываются с заряженной стационарной фазой при низкой ионной силе. Связанные белки могут быть элюированы или путем увеличения ионной силы буфера или путем регулирования рН.

Белки могут быть также аффинно очищены неизбирательным образом. При неселективной очистке лиганд, присоединенный к стационарной фазе, связывается с группой белков с аналогичными свойствами связывания. Пример неселективной очистки – очистка ДНК-связывающих белков. Гепарин мимикрирует ДНК как в ее структуре, так и в заряде, и может быть использован в качестве лиганда для аффинной очистки ДНК-связывающих белков. В то время как все ДНК-связывающие белки теоретически могут связываться с этой неподвижной фазой, большинство других белков будут протекать через нее, не связываясь, что приводит к достаточному обогащению белка, представляющего интерес. Другим примером является обогащение антител путем связывания их константной (Fc) области с лигандом, белком A, G или белком L. Аффинные колонки от GE Healthcare с белком A являются частым выбором [13-15], точно также как и с белком G [16].

Используя аналогичный способ связывания (антитело, связанное с белком A, G или L), антиген-связывающая область антитела (FAB) по-прежнему доступна для связывания со специфическим антигеном. Таким образом, специфические белки могут быть очищены на основании специфического взаимодействия между парами лиганд-антитело и антитело-антиген.

Общие проблемы и способы их устранения приведены в Таблице 6.

ПроблемаПричинаРешение
Белок не связываетсяТаг не транслировался или не доступенПроверьте последовательность плазмиды или поместите таг в другое место
Условия для связывания не подходятПодберите подходящие условия буфера
Не было предоставлено достаточно времени для связыванияУменьшите скорость течения или остановите течение для пролонгации инкубации
Белок не элюируетАффинность между лигандом и тагом очень высокаяУвеличьте концентрацию конкурирующих молекул (специфическое) или измените жесткость элюирующего раствора (неспецифическое)
Белок агрегировал на колонкеПодберите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Низкое разрешениеСкорость течения или слишком быстрое, или слишком медленноеУстановите скорость течения
Колонка не была достаточно промытаПромойте более жестким буфером; очистите стационарную фазу в соответствии с рекомендациями производителя
Белок агрегировал на колонкеУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильностю белка
Условия элюции не являются достаточно жесткимиУвеличьте концентрацию конкурирующих молекул (специфическое) или установите иные условия (неспецифическое)
Белок теряет активность во время процедурыБелок денатурирует или агрегируетУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильностю белка
Кофактор, требуемый для активности, был удален во время очисткиДобавьте кофактор
Таблица 6. Общие проблемы и способы их устранения в аффинной хроматографии. Данные обобщены от GE.
Ионообменная хроматография (ИОХ)

Ионообменная хроматография (ИОХ) разделяет белки на основе их общего поверхностного заряда через электростатические взаимодействия, которые происходят между белками и заряженной стационарной фазой. Существуют два типа ИОХ: (1) анионообменная (положительно заряженная стационарная фаза, которая связывается с отрицательно заряженными белками); и (2) катионообменная (отрицательно заряженная стационарная фаза, которая связывается с положительно заряженными белками). ИОХ широко используется в качестве промежуточной стадии в схеме очистки белков; тем не менее, она может давать высокое разрешение для некоторых белков при использовании на ранних или поздних этапах процесса очистки.

Суммарный заряд белка зависит от аминокислотного состава и любых ковалентно присоединенных модификаций. Общий заряд белка зависит от рН растворителя, в котором он растворен, поскольку растворитель участвует в обмене ионов водорода с белками. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) белка представляет собой рН, при котором белок не имеет общего заряда. При рН выше изоэлектрической точки pI белок будет иметь отрицательный заряд, в то время как при рН ниже изоэлектрической точки pI – положительный заряд. Таким образом, рН растворителя может быть отрегулирован для облегчения связывания с ИОХ или содействовать элюированию связанного белка.

Выделение и очистка белков Рисунок 7
Рисунок 7. Гидрофобная хроматография. При высокой ионной силе белки частично десольватированы, заставляя их принимать альтернативные конформации, при которых обычно заглубленные гидрофобные остатки становятся более экспонированными. Эти остатки могут затем образовывать гидрофобные взаимодействия с гидрофобными функциональными группами, конъюгированными с матрицей. Понижение ионной силы заставляет белок рефолдировать в нативную конформацию, экранируя гидрофобные остатки. Это приводит к уменьшению гидрофобных взаимодействий между белком и стационарной фазой, облегчая элюцию белка.

Теоретически все белки могут связываться как с катионообменной, так и анионообменной, если рН буфера установлен соответствующим образом. Тем не менее, при очистке белков стабильность белка является наиболее важным фактором при выборе условий очистки и, таким образом, наиболее подходящей колонки для связывания белка. Поэтому необходимо определить, влияют ли на стабильность и функции белков условия, необходимые для связывания с каждой из форм ИОЭ. Как правило, условия для связывания с одним типом ИОХ является более подходящими для конкретного белка, чем с другим типом ИОХ.

Знание изоэлектрической точки (ИЭТ) белка может помочь в определении наиболее подходящего типа ионообменной хроматографии. Есть онлайн инструменты для расчета теоретической ИЭТ pI белка EXPASY. Эти расчеты основаны исключительно на аминокислотной последовательности белка и не принимают во внимание его трехмерную структуру. В нативном состоянии некоторые аминокислотные остатки белка более открыты и доступны, чем другие, и, таким образом, фактическая ИЭТ и общая поверхность заряда иногда отличаются от тех, которые определены теоретически [17]. Распределение аминокислот по отношению друг к другу также может повлиять на pI белка [18], и это также не принимается во внимание в теоретических расчетах pI. Некоторые методы позволяют экспериментально определить ИЭТ белка в его нативном состоянии, в том числе электрофоретическое изоэлектрическое фокусирование [19], капиллярное изоэлектрическое фокусирование [20] и более недавний люминесцентный подход с высокой пропускной способностью [21].

Как правило, связывание белка с ИОХ должно быть определено методом проб и ошибок с использованием растворителей с диапазоном значений рН для того, чтобы определить оптимальный рН для удержания белка. Значение рН растворителя, которое составляет около одной единицы рН от изоэлектрической точки pI, обычно достаточно для связывания белка [22] ; однако, в некоторых случаях требуется рН больше одной единицы от изоэлектрической точки pI [23].

Неподвижная фаза ИОХ состоит из инертной, основанной на агарозе или полимерной матрице с ковалентно пришитыми заряженными группами. Доступны матричные частицы различных размеров и могут быть либо непористыми, либо содержать поры разного размера. Выбор матрицы зависит от требуемой вяжущей способности, разделяющего разрешения и скорости течения. Меньшие размеры частиц дают более высокое разделяющее разрешение, но требуют более низких скоростей течения, что займет больше времени. Пористые матрицы дают более высокую связывающую способность, чем непористые. В непористую матрицу белки не могут войти и, таким образом, обеспечивается более высокий уровень выхода образца, более высокое разделяющее разрешение и более короткое время прогонки, чем в пористых матрицах. Одно исследование показало, что для большинства белков разделяющая разрешающая способность и выход образца схожи при разделении в пористой или непористой матрице; однако, для более крупных белков пористые матрицы вызывают потерю разделяющего разрешения из-за эксклюзионного эффекта [24].

Выделение и очистка белков Рисунок 8
Рисунок 8. Белок, элюированный из колонки с гидрофобным взаимодействием с помощью уменьшения солевого (сульфат аммония) градиента. Фракции анализировали на общее содержание белка и специфическую активность интересующего белка. Пик с центром на фракции 45 содержит белок, представляющий интерес, о чем свидетельствует активность белка. Взято из http://www.insectscience.org/9.04/.

Четыре заряженные функциональные группы, наиболее часто используемые в ИОХ, показаны ниже. Они классифицируются как сильные и слабые обменники, при этом сильные обменники ионизируются в более широком диапазоне рН, чем слабые.

Анионный обмен (положительно заряженная стационарная фаза):

  1. четвертичный аммоний (Q) - сильный анионит
  2. диэтиламиноэтил (DEAE) - слабый анионит

Катионный обмен (отрицательно заряженная стационарная фаза):

  1. метил сульфонат (S) - сильный катионит
  2. карбоксиметил (КM) - слабый катионит

Сильные обменники следует использовать, когда рН, требуемы для связывания, является очень кислым или основным (предполагается, что этот рН также подходит для поддержания стабильности белка), так как функциональные группы остаются заряженными в более широком диапазоне рН [25]. Слабые обменники, как было показано, обеспечивают меньшее удерживание некоторых белков, что позволяет им элюировать при более низкой ионной силе раствора [26]. Поскольку высокая ионная сила может повлиять на стабильность некоторых белков [27], слабые обменники могут быть более подходящими для белков, которые не требуют экстремальных значений рН для связывания.

В ионообменной хроматографии неподвижную фазу сначала уравновешивают буфером с низкой ионной силой. Образец белка затем загружают на стационарную фазу в том же самом буфере низкой ионной силы, используемом для уравновешивания. Связанный белок тщательно промывают перед элюированием буфером с более высокой ионной силой или, в некоторых случаях, буфером с измененным рН (Рисунок 6). Противоионы в буфере для элюирования взаимодействуют с заряженной стационарной фазой, вытесняя связанный белок. Некоторые соли более эффективны для использования в ионообменной хроматографии, чем другие, из-за их способности вытеснять связанные белки и влиять на стабильность белка [28]. Обычно NaCl или KCl используется для элюирования, Na+ или K+ выступающие в качестве противокатионов в катионообменной хроматографии и Cl- выступающий в качестве противоаниона в анионообменной хроматографии. В качестве альтернативы рН буфера может быть изменен, чтобы уменьшить заряд белка и нарушить его взаимодействие с неподвижной фазой. Для белков, связанных с неподвижной катионообменной фазой, увеличение рН буфера приведет к меньшему положительному заряду на белке и последующему элюированию из колонки. Для белков, связанных с неподвижной анионообменной фазой, уменьшение рН буфера приведет к меньшему отрицательному заряду на белке и последующему элюирование из колонки.

Выделение и очистка белков Рисунок 9
Рисунок 9. Смесь из трех белков различного гидродинамического радиуса загружают на колонку эксклюзионной/вытеснительной хроматографии. Большие белки элюируют первыми, так как они не могут входить в поры матрицы и проходят напрямую через колонку. Более мелкие белки могут проникать в поры, имеют более извилистый путь и, таким образом, занимают больше времени, чтобы пройти через матрицу и элюцировать из колонки.

В качестве альтернативы рН буфера может быть отрегулирован таким образом, чтобы белок, представляющий интерес, не связывался с неподвижной ионообменной фазой, в то время как примесные белки связывались. В этом случае интересующий белок собирается в проточном растворе, в то время как некоторые примесные белки удаляются путем их связывания с неподвижной фазой.

Как и другие хроматографические методы, ионообменная хроматография может потребовать оптимизации и устранения проблем, чтобы достичь оптимальных условий для связывания белка, элюирования и адекватного разделяющего разрешения.

ПроблемаПричинаРешение
Белок не связываетсяКолонка не была уравновешенаПрогоните больше уравновешивающего буфера через колонку и повторно загрузите образец белка
Слишком высокая ионная сила связывающего буфераПонизьте ионную силу буфера
pH не достаточно отличается от pIПодберите pH буфера (понизьте для катионообменной, повысьте для анионообменной)
Белок не элюируетСлишком низкая ионная сила буфераУвеличьте ионную силу
Белок агрегирует на колонкеУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Низкое разделяющее разрешениеСкорость течения слишком высокая или низкаяПодберите скорость течения
Колонка не была промыта достаточноПромойте буфером с более высокой ионной силой; прочистите стационарную фазу в соответствии с рекомендациями производителя
Белок агрегировал на колонкеУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Теряет активность во время процедуры выделенияБелок денатурировал или агрегировалУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Кофактор, необходимый для активности, был удален во время очисткиДобавьте кофактор
Таблица 7. Проблемы и их решение в ионообменной хроматографии. Данные обобщены от GE.
Гидрофобная хроматография (ГФХ)

Гидрофобная хроматография (ГФХ) разделяет белки на основе их гидрофобности и часто используется в качестве промежуточной стадии в схеме очистки. Белки связываются с неподвижной фазой в буфере с высокой ионной силой, таким образом, ГФХ обычно может быть выполнена сразу после ионообменной хроматографии без замены буфера или его разбавления. ГФХ также обычно выполняется после осаждения сульфатом аммония, процедуры, которую можно использовать для быстрого удаления белков, поскольку соль осаждает некоторые, но не все белки. ГФХ иногда применяется на ранних стадиях схемы очистки или в качестве конечной стадии удаления следовых примесей из интересующего белка.

Присутствие ионов соли в растворе может привести к частичному разворачиванию белка и экспозиции, как правило, скрытых гидрофобных остатков. Белки, которые связываются с неподвижной фазой, принимают нативную конформацию, когда добавляют буфер с более низкой ионной силой. Это приводит к уменьшению экспозиции гидрофобных остатков, которые могут взаимодействовать с неподвижной фазой, и облегчает элюирование из колонки. Для белков, которые могут повторно сворачиваться (рефолдировать) после уменьшения ионной силы буфера, ГФХ может быть ценным хроматографическим методом очистки.

Как правило, ионная сила буфера для связывания должна быть настолько низкой, насколько это возможно, чтобы связать белок, представляющий интерес, и в то же время предотвратить его осаждение. Если высока ионная сила, необходимая для связывания белка, вызывает осаждение представляющего интерес белка, тогда может быть использован буфер с низкой ионной силой. В этом случае процедура хроматографии может быть использована для отделения всех связывающихся белков от белка, представляющего интерес, который протекает без связывания.

Перед загрузкой образца на колонку стационарная фаза должна быть уравновешена буфером с высокой ионной силой (тот же самый буфер, в котором образец белка будет наноситься). Образец затем наносится на колонку, колонку интенсивно промывают, и белок элюируют буфером с низкой ионной силой (Рисунки 7 и 8).

Неподвижная фаза, используемая в гидрофобной хроматографии, состоит из базовой матрицы сшитой агарозы или синтетического кополимера. Затем с матрицей конъюгируют алкильные или арильные лиганды, что обеспечивает специфичность связывания для гидрофобных молекул.

Виды функциональных групп:

  1. Алкил - углеводородная цепь различной длины; часто используется бутиловая или октильная группа. Связывающая способность стационарной фазы возрастает с увеличением длины алкильной цепи [29]. Функциональные группы связывают белки исключительно на основании их гидрофобности
  2. Арил - функциональная группа с ароматическим кольцом; часто это фенильная группа. Арильные группы обеспечивают повышенную специфичность, так как белки могут также взаимодействовать с функциональной группой через взаимодействие между ароматическими кольцами.

Тип и концентрация соли, используемые для связывания и элюирования, должны быть определены эмпирически для каждого белка. Кроме того, необходимо убедиться в рефолдинге и функционировании белка после его элюирования.

Как и другие формы хроматографии на колонке, оптимальная процедура ГФХ может потребовать решение многих проблем. Подборка буферных условий и стационарной фазы требуются отдельно для каждого белка, чтобы обеспечить оптимальное разделение.

ПроблемаПричинаРешение
Белок не связываетсяКолонка не была уравновешенаПрогоните больше уравновешивающего буфера через колонку и повторно загрузите образец белка
Слишком низкая ионная сила связывающего буфераУвеличьте ионную силу буфера
Белок агрегировал при использованной ионной силе буфераПонизьте ионную силу буфера или попробуйте иную соль
Белок не элюируетИонная сила элюирующего буфера слишком высокаяУменьшите ионную силу буфера
Белок агрегировал на колонкеУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Слишком высокое удерживание в колонкеПопробуйте иную стационарную фазу, которая дает меньшее задерживание
Низкое разделяющее разрешениеСкорость течения или слишком высокая, или слишком низкаяОтрегулируйте скорость течения
Колонка не была достаточно промытаПромойте раствором с более низкой ионной силой; прочистите стационарную фазу в соответствии с рекомендациями производителя
Белок агрегировал на колонкеУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Плохое удерживание в колонкеПопробуйте иную стационарную фазу, дающую большее удерживание
Белок теряет активность во время процедурыБелок денатурировал или агрегировалУстановите условия буфера, обеспечивающие большую стабильность белка
Белок не принимает свою нативную конформациюПопробуйте провести связывание с иной солью или ионной силой буфера; включите дополнительные компоненты для стабильности белка
Кофактор, необходимый для активности, был удален во время очисткиДобавьте кофактор
Таблица 8. Проблемы и их решение в гидрофобной хроматографии. Данные обобщены от GE.
Вытеснительная/эксклюзионная хроматография (ЭХ)

Вытеснительная/эксклюзионная хроматография разделяет белки по их гидродинамическим радиусам, свойство, определяемое размером и формой молекулы. В отличие от других хроматографических процедур, описанных выше, белки не связываются с неподвижной фазой в ЭХ. Вместо этого белки отделяются друг от друга из-за различий в скорости, при которой они продвигаются через инертную стационарную фазу (Рисунок 9).

ЭХ наиболее часто используется на заключительных этапах схемы очистки белка из-за ее способности разделять различные формы/состояния белка. Олигомерные молекулы [30], развернутые молекулы [31] и трункированные молекулы [32] белка могут быть отделены от нативного белка. Часто ЭХ используется в качестве более быстрого и надежного способа обмена буфера, чем диализ, поскольку она совместима с большим числом растворителей и требует меньшего количества буфера. Один растворитель используют на протяжении всей процедуры ЭХ, и коммерчески доступные стационарные фазы ЭХ совместимы с наиболее часто используемыми компонентами буфера.

Используемый тип стационарной фазы и длина колонки играют важную роль в разделяющем разрешении белков. Существует несколько типов коммерчески доступных стационарных фаз, и выбор зависит как от молекулярной массы белков, требующих разделения, так и условий, при которых будет выполняться разделение.

Тип стационарной фазыМатрицаОсобенности
СефадексПоперечно-сшитый декстран и эпихлоргидрин
  • Обеспечивает быстрый обмен буфера и разделение группы
  • Полезен для определения молекулярной массы
  • Автоклавируемый
  • Матрица может сжаться в некоторых растворителях
  • Доступны специальные типы Сефадекса для использования с органическими растворителями
СефакрилСшитые аллилдекстран и N, N-метилен бисакриламид
  • Разделяет молекулы в широком диапазоне молекулярных масс
  • Автоклавируемый
  • Работает с водяными и органическими растворителями
  • Высокое извлечение
СефарозаСшитая агароза
  • Разделяет молекулы в широком диапазоне молекулярных масс
  • Высокое извлечение
  • Не автоклавируется
СуперозаСильно сшитая агароза
  • Совместима с водяными и органическими растворителями
  • Автоклавируемая
  • Возможны гидрофобные взаимодействия между белками и матрицей
  • Совместима с вязкими растворителями
СупердексСшитые агароза и декстран
  • Совместим с водяными и органическими растворителями
  • Автоклавируемый
  • Высокое разделяющее разрешение
  • Высокое извлечение
Таблица 9. Типы коммерчески доступных стационарных фаз для эксклюзионной/вытеснительной хроматографии и особенности каждого из них. Данные обобщены от GE and Simga-Aldrich.

Супердекс часто является лучшим выбором для типичных процедур ЭХ, поскольку он совместим с большинством растворителей и предлагает самое высокое разделяющее разрешение из всех имеющихся стационарных фаз.

Как и у других хроматографических методов, у ЭХ есть свои преимущества и недостатки, и решение об использовании этого метода зависит как от белка, так и его дальнейшего использования.

Преимущества ЭХ:

  1. Обеспечивает обмен буфера и обессоливание.
  2. Позволяет разделение сходных видов молекул (например, укороченных форм и олигомеров), которые не могут быть разделены другими методами очистки.
  3. Совместима со многими растворителями.
  4. Не зависит от какого-либо конкретного свойства белка для удерживания и элюирования.

Недостатки ЭХ:

  1. Упаковка колонки значительно влияет на производительность.
  2. Может иметь неспецифические взаимодействия между белком и смолой, что уменьшает разрешение.
  3. Обеспечивает низкое разрешение для сложных белковых смесей.
  4. Образец должен быть загружен в небольшом объеме для адекватного разделяющего разрешения. Это может быть проблематичным для белков, которые осаждаются при высоких концентрациях.

Оптимизация условий ЭХ для достижения максимального разрешения часто занимает много времени, но некоторые факторы могут иметь огромное влияние на разделяющее разрешение.

Условия, которые увеличивают разделяющее разрешение в ЭХ:

  1. Минимизируйте объем образца. Чем меньше объем, тем элюированные фракции будут менее диффузионными.
  2. Добавьте соль в буфер. Небольшое количество соли поможет предотвратить неспецифическое взаимодействие между белком и стационарной фазой. Это позволит всем молекулам белка продвигаться по колонке равномерно.
  3. Установите умеренную скорость течения. Быстрый прогон не даст достаточного времени для малых молекул войти в матричные поры, в то время как слишком низкая скорость течения вызовет диффузию образца.
  4. Убедитесь в том, что вязкость образца и растворителя схожи. Установите условия раствора образца таким образом, чтобы они были близки к таковым проточного буфера.
  5. Отрегулируйте длину колонки. Слишком короткая колонка не дает адекватного разделения белков. Слишком же длинная колонка будет приводить к диффузии образца белка.
  6. Повторно упакуйте колонку. Упаковка колонки может иметь огромное влияние на разделение.

Если частицы плохо рассредоточены или пузырьки воздуха попали в колонку, продвижение по стационарной фазе не будет происходить должным образом. Кроме того, высохшая колонка должна быть перепакована. Плохая упаковка колонки часто причина необъяснимо низкого разделяющего разрешения.

Поскольку ЭХ не разделяет белки на основании их взаимодействия с функциональной группой, все белки элюируются при тех же самых условиях и, таким образом, разделение может быть гарантировано только для белков самого различного гидродинамического радиуса. Поэтому ЭХ не является подходящим хроматографическим методом на начальной стадии схемы очистки при наличии большого количества примесных белков. ЭХ, однако, предлагает быстрый и надежный способ удаления солей или небольших молекул из образца между ранними или промежуточными стадиями очистки. В заключительной стадии очистки, когда имеются только следовые количества примесей, ЭХ является ценным методом для выделения белка и обмена на буфер хранения.

Элюирование белка и анализ
Методы элюирования белка

Белки, которые связываются с неподвижной фазой, элюируются растворителем, который разрушает связывающие взаимодействия. Эти условия элюирования различаются как по типу хроматографии, так и свойствам интересующего белка. Существуют три основных способа элюирования белка: элюирование порционное, ступенчатое элюирование, и линейное градиентное элюирование. Выбор зависит от выполняемого типа хроматографии и требуемого разделяющего разрешения.

  1. Порционное - элюирование вытесняет все связанные белки в одну стадию одним раствором. Этот механизм работает лучше всего для хроматографических процедур, основанных на очень специфическом взаимодействии (т.е., аффинная хроматография). Порционное элюирование не дает никакого разрешения, но оно идеально подходит для очень быстрого избавления от загрязнений. Требует предварительного знания буферных условий, необходимых для вытеснения белка, представляющего интерес
  2. Ступенчатое – множественные последовательные элюции с более жесткими условиями на каждом последующем шаге. При ступенчатом элюировании количество собранных фракций зависит от количества последовательных условий элюирования. Поэтапное элюирование обеспечивает лучшее разрешение, чем порционное, но хуже, чем разделяющее разрешение линейного градиентного элюирования.
  3. Линейный градиент – собирается множество последовательных фракций, в то время как условия элюирования корректируются линейным способом. Линейный градиент обеспечивает самое высокое разрешение для ионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии. Как правило, собирается большое количество последовательных фракции.

Эксклюзионная хроматография не требует каких-либо методов элюирования, поскольку никаких взаимодействий не происходит между белком и стационарной фазой. Белки загружают на колонку, и большое количество фракций собирают до тех пор, пока все белки не элюируют, без изменения условий буфера в течение всей процедуры.

В идеальном случае буфер для элюирования одной колонки совместим с последующей хроматографической колонкой, что исключает необходимость замены буфера или диализа между стадиями очистки.

Анализ чистоты фракции

После каждого хроматографического разделения фракции должны быть проанализированы для определения фракций, содержащих представляющий интерес белок, и относительной чистоты каждой из этих фракций. Этот анализ необходимо проводить после каждого шага, чтобы определить, какие фракции должны быть объединены для последующего использования. Для определения чистоты необходим такой анализ, который может измерять количество специфического белка по отношению к количеству суммарного белка. Следующие тесты обычно используются для анализа чистоты:

  1. Электрофорез в натрий додецилсульфат полиакриламидном геле (SDS-PAGE) - денатурирующий гель, который разделяет белки в зависимости от их размера. Коммерчески доступные красители позволяют визуальное определить все белки в образце, давая качественную оценку чистоты белка (Рисунок 10). SDS-PAGE не является подходящим для анализа больших объемов фракций и может занять несколько часов; тем не менее, это наиболее часто используемый метод из-за своей легкости и дешевизны.
  2. Спектроскопия - метод для анализа оптических свойств белков. Этот метод анализа чистоты белка подходит только для белков, таких как цитохром Р450, которые обладают уникальными спектроскопическими свойством. Белки в этом семействе поглощают свет при длине волны, при которой другие белки не поглащают (около 420 нм [33] ), поэтому сравнение оптической плотности при 420 нм по сравнению с 280 нм (длина волны, при которой все белки поглощают) может служить количественной мерой чистоты белка. Этот метод является быстрым и с высокой пропускной способностью, но подходит только для некоторых белков
  3. Активность белка - ферментный тест, который зависит от функций представляющего интерес белка. Этот метод оценки чистоты белка часто сочетается с другой формой определения концентрации белка для расчета активности по сравнению с общей концентрацией белка. Для определения активности пригодны только те белки, активность которых можно легко контролировать в формате с высокой пропускной способностью, например, протеазы. Для некоторых белков анализ активности - это быстрый и надежный метод для обнаружения белка. Измерение активности часто идеально подходит для ферментов, так как белок, который потерял активность, может быть исключен из последующего использования.
Хранение очищенного белка

Когда белки считаются достаточно чистыми для использования в экспериментальных исследованиях, их следует хранить надлежащим образом. Выбор конечного буфера для хранения столь же важен, как и выбор буферов, используемых во время схемы очистки, и должен зависеть от стабильности белка и условий, необходимых для его дальнейшего применения. Часто эксклюзионная хроматография используется в качестве конечной стадии в схеме очистки, поэтому буфер для хранения может быть использован на этой стадии для эффективной замены буфера. Чистые фракции могут быть объединены для непосредственного хранения. В качестве альтернативы окончательные окончательные объединенные фракции могут быть диализованы в выбранный буфер перед хранением.

Условия хранения белка зависят от самого белка, представляющего интерес, и должны быть оптимизированы таким образом, чтобы белок сохранял структурную и функциональную стабильность в течение длительного периода хранения. Дополнительные компоненты часто включены в буфер для хранения для повышения срока хранения очищенных белков, и часто требуется метод проб и ошибок, чтобы определить оптимальные условия, так как каждый белок ведет себя по-разному.

Анализ литературы, цитирующей методы очистки белка, проведенный Labome

Labome провел анализ случайно выбранных 261 публикаций, цитирующих методы очистки белка, с общим числом ссылок 620. Таблица 10 включает главных поставщиков и методы очистки. Аффинная и эксклюзионная хроматографии являются наиболее частыми хроматографическими методами, процитированными в литературе. GE Healthcare является преобладающим поставщиком материалов для всех методов, Qiagen является важным поставщиком материалов для аффинной очистки белков на основе HIS-тага, а Sigma Aldrich – на основе FLAG-тага.

ТипПоставщикБрендnumЦитирование
аффинность
HISQiagenNi-NTA агароза52 [7, 14, 34-82]
GE HealthcareNi сефароза, HisTrap FF/HP20 [6, 63, 78, 83-99]
ClontechTALON металло-аффинная14 [6, 100-112]
BD BiosciencesTALON металло-аффинная смола5 [113-117]
Sigma-AldrichNi-NTA агароза5 [9, 118-121]
GST
GE Healthcareглутатион сефароза 4B53 [9, 10, 38-40, 44, 45, 52, 54, 57, 66, 75, 76, 78, 81, 82, 93, 98, 106, 113, 115, 122-153]
Sigma-Aldrichглутатион агароза3 [69, 154, 155]
EMD Milliporeглутатионовые шарики2 [156, 157]
FLAGSigma-AldrichFLAG M219 [52, 88, 134, 158-169]
Другие процитированные системы очистки белка, основанные на аффинности, включают Vector Laboratories агароза-связанный Джакалин для О-связанных гликопротеинов [110], New England Biolabs амилозная смола для мальтоза-связывающего белкового тага [69, 109, 170], Roche анти-Протеин C аффинная матрица [88], основанные на стрепбиотине системы от Thermo Fisher Pierce [109, 171-173], EMD Millipore [174, 175], Qiagen [96], IBA [51] и Sigma-Aldrich [171], Sigma-Aldrich Myc иммунно-аффинная смола [167], для металл-связывающих белков GE Healthcare Chelating Sepharose Fast Flow [176] и GE Healthcare HiTrap IMAC HP колонка [177], гапариновые колонки от GE Life Sciences [10, 176, 178, 179], GE Healthcare Life Sciences HiTrap протеин A [14], GE Healthcare IgG Сефароза [180], GE Healthcare поли(A)-Сефароза 4B [10], Thermo Scientific SulfoLink смола [181], BioRad Affi-Gel 10 смола [181], RepliGen протеин A агароза [181], and Sigma V5-агароза [143].
эксклюзионная хроматография
СупердексGE-Healthcare74 [5, 7, 49, 51, 54, 55, 57, 63, 64, 66, 70, 73, 75-78, 82, 84, 87, 91, 92, 94, 96, 97, 102, 105, 106, 111, 117, 121, 125, 137, 166, 176, 177, 179, 182-204]
СуперозаGE Healthcare11 [10, 49, 64, 74, 82, 99, 134, 194, 204-206]
СефарозаGE Healthcare2 [68, 207]
Ионообменная хроматография
анионGE HealthcareMonoQ колонка5 [58, 70, 98, 194, 208]
GE HealthcareHiTrap Q6 [64, 67, 71, 78, 99, 209]
GE HealthcareSource 15Q2 [69, 105]
GE HealthcareQ-сефароза1 [76]
WhatmanDE52 анионная смола1 [178]
катионGE HealthcareMono S колонка3 [49, 76, 96]
гидрофобная хроматография
GE healthcareфенил сефароза CL-4B1 [45]
Sigma-Aldrichфенил сефароза1 [76]
Таблица 10. Статистика анализа 98 публикаций со ссылкой на системы очистки белка, проведенного Labome. num: число публикаций.

На основании проанализированной литературы образцы смеси белков были приготовлены с помощью EMD Millipore BugBuster [187], [175], [210] или AVESTIN EmulsiFlex C-3 разрушителя клеток [58, 211] и были сконцентрированы с помощью EMD Millipore Amicon Ultra концентратора [10, 79, 99, 110, 117, 167, 173, 178, 189], Thermo Fisher Sartorius центрифужных колонок [212] или Vivaspin концентратора [107, 117, 187, 209].

Ссылки
  1. Good N, Winget G, Winter W, Connolly T, Izawa S, Singh R. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 1966;5:467-77 pubmed
  2. Grady J, Chasteen N, Harris D. Radicals from "Good's" buffers. Anal Biochem. 1988;173:111-5 pubmed
  3. Desmarais W, Bienvenue D, Bzymek K, Holz R, Petsko G, Ringe D. The 1.20 A resolution crystal structure of the aminopeptidase from Aeromonas proteolytica complexed with tris: a tale of buffer inhibition. Structure. 2002;10:1063-72 pubmed
  4. Ghalanbor Z, Ghaemi N, Marashi S, Amanlou M, Habibi-Rezaei M, Khajeh K, et al. Binding of Tris to Bacillus licheniformis alpha-amylase can affect its starch hydrolysis activity. Protein Pept Lett. 2008;15:212-4 pubmed
  5. Pejchal R, Doores K, Walker L, Khayat R, Huang P, Wang S, et al. A potent and broad neutralizing antibody recognizes and penetrates the HIV glycan shield. Science. 2011;334:1097-103 pubmed publisher
  6. Cruz-Migoni A, Hautbergue G, Artymiuk P, Baker P, Bokori-Brown M, Chang C, et al. A Burkholderia pseudomallei toxin inhibits helicase activity of translation factor eIF4A. Science. 2011;334:821-4 pubmed publisher
  7. Shenoy A, Wellington D, Kumar P, Kassa H, Booth C, Cresswell P, et al. GBP5 promotes NLRP3 inflammasome assembly and immunity in mammals. Science. 2012;336:481-5 pubmed publisher
  8. Hernandez J, Stein A, Behrmann E, Riedel D, Cypionka A, Farsi Z, et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 2012;336:1581-4 pubmed publisher
  9. Mukherjee S, Behar M, Birnbaum H, Hoffmann A, Wright P, Ghosh G. Analysis of the RelA:CBP/p300 interaction reveals its involvement in NF-κB-driven transcription. PLoS Biol. 2013;11:e1001647 pubmed publisher
  10. Bohne A, Schwarz C, Schottkowski M, Lidschreiber M, Piotrowski M, Zerges W, et al. Reciprocal regulation of protein synthesis and carbon metabolism for thylakoid membrane biogenesis. PLoS Biol. 2013;11:e1001482 pubmed publisher
  11. Arakawa T, Philo J, Tsumoto K, Yumioka R, Ejima D. Elution of antibodies from a Protein-A column by aqueous arginine solutions. Protein Expr Purif. 2004;36:244-8 pubmed
  12. Chong S, Mersha F, Comb D, Scott M, Landry D, Vence L, et al. Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element. Gene. 1997;192:271-81 pubmed
  13. Jochum C, Beste M, Stone D, Graves S, Storb R. Development and in vitro characterization of canine CD40-Ig. Vet Immunol Immunopathol. 2008;123:260-5 pubmed publisher
  14. Corti D, Voss J, Gamblin S, Codoni G, Macagno A, Jarrossay D, et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science. 2011;333:850-6 pubmed publisher
  15. Shen Y, Tenney A, Busch S, Horn K, Cuascut F, Liu K, et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 2009;326:592-6 pubmed publisher
  16. Li F, Ravetch J. Inhibitory Fcγ receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science. 2011;333:1030-4 pubmed publisher
  17. Salaman M, Williamson A. Isoelectric focusing of proteins in the native and denatured states. Anomalous behaviour of plasma albumin. Biochem J. 1971;122:93-9 pubmed
  18. Vesterberg O. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. V. Separation of myoglobins and studies on their electro-chemical differences. Acta Chem Scand. 1967;21:206-16 pubmed
  19. Awdeh Z, Williamson A, Askonas B. Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its application to immunoglobulins. Nature. 1968;219:66-7 pubmed
  20. Righetti P. Determination of the isoelectric point of proteins by capillary isoelectric focusing. J Chromatogr A. 2004;1037:491-9 pubmed
  21. Pihlasalo S, Auranen L, Hanninen P, Harma H. Method for estimation of protein isoelectric point. Anal Chem. 2012;84:8253-8 pubmed publisher
  22. Ahamed T, Chilamkurthi S, Nfor B, Verhaert P, van Dedem G, van der Wielen L, et al. Selection of pH-related parameters in ion-exchange chromatography using pH-gradient operations. J Chromatogr A. 2008;1194:22-9 pubmed
  23. Trodler P, Nieveler J, Rusnak M, Schmid R, Pleiss J. Rational design of a new one-step purification strategy for Candida antarctica lipase B by ion-exchange chromatography. J Chromatogr A. 2008;1179:161-7 pubmed
  24. Duncan J, Chen A, Siebert C. Performance evaluation of non-porous versus porous ion-exchange packings in the separation of proteins by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr. 1987;397:3-12 pubmed
  25. Staby A, Jensen R, Bensch M, Hubbuch J, Dünweber D, Krarup J, et al. Comparison of chromatographic ion-exchange resins VI. Weak anion-exchange resins. J Chromatogr A. 2007;1164:82-94 pubmed
  26. DePhillips P, Lenhoff A. Determinants of protein retention characteristics on cation-exchange adsorbents. J Chromatogr A. 2001;933:57-72 pubmed
  27. von Hippel P, Wong K. On the conformational stability of globular proteins. The effects of various electrolytes and nonelectrolytes on the thermal ribonuclease transition. J Biol Chem. 1965;240:3909-23 pubmed
  28. Tsumoto K, Ejima D, Senczuk A, Kita Y, Arakawa T. Effects of salts on protein-surface interactions: applications for column chromatography. J Pharm Sci. 2007;96:1677-90 pubmed
  29. Er-El Z, Zaidenzaig Y, Shaltiel S. Hydrocarbon-coated sepharoses. Use in the purification of glycogen phosphorylase. Biochem Biophys Res Commun. 1972;49:383-90 pubmed
  30. Woodbury R, Hardy S, Randall L. Complex behavior in solution of homodimeric SecA. Protein Sci. 2002;11:875-82 pubmed
  31. Corbett R, Roche R. Use of high-speed size-exclusion chromatography for the study of protein folding and stability. Biochemistry. 1984;23:1888-94 pubmed
  32. Kim T, Paik S, Yang C. Structural and functional implications of C-terminal regions of alpha-synuclein. Biochemistry. 2002;41:13782-90 pubmed
  33. Schenkman J, Jansson I. Spectral analyses of cytochromes P450. Methods Mol Biol. 2006;320:11-8 pubmed
  34. Heisel S, Ketter R, Keller A, Klein V, Pallasch C, Lenhof H, et al. Increased seroreactivity to glioma-expressed antigen 2 in brain tumor patients under radiation. PLoS ONE. 2008;3:e2164 pubmed publisher
  35. Tisserant A, König H. Signal-regulated Pre-mRNA occupancy by the general splicing factor U2AF. PLoS ONE. 2008;3:e1418 pubmed publisher
  36. Miura G, Roignant J, Wassef M, Treisman J. Myopic acts in the endocytic pathway to enhance signaling by the Drosophila EGF receptor. Development. 2008;135:1913-22 pubmed publisher
  37. Yang X, Goldberg M, He M, Xu H, Blevins J, Norgard M. Differential expression of a putative CarD-like transcriptional regulator, LtpA, in Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 2008;76:4439-44 pubmed publisher
  38. Mazurkiewicz P, Thomas J, Thompson J, Liu M, Arbibe L, Sansonetti P, et al. SpvC is a Salmonella effector with phosphothreonine lyase activity on host mitogen-activated protein kinases. Mol Microbiol. 2008;67:1371-83 pubmed publisher
  39. Vafiadaki E, Arvanitis D, Pagakis S, Papalouka V, Sanoudou D, Kontrogianni-Konstantopoulos A, et al. The anti-apoptotic protein HAX-1 interacts with SERCA2 and regulates its protein levels to promote cell survival. Mol Biol Cell. 2009;20:306-18 pubmed publisher
  40. Zhao Y, Takeyama K, Sawatsubashi S, Ito S, Suzuki E, Yamagata K, et al. Corepressive action of CBP on androgen receptor transactivation in pericentric heterochromatin in a Drosophila experimental model system. Mol Cell Biol. 2009;29:1017-34 pubmed publisher
  41. Little H, Rorick N, Su L, Baldock C, Malhotra S, Jowitt T, et al. Missense mutations that cause Van der Woude syndrome and popliteal pterygium syndrome affect the DNA-binding and transcriptional activation functions of IRF6. Hum Mol Genet. 2009;18:535-45 pubmed publisher
  42. Ydenberg C, Rose M. Antagonistic regulation of Fus2p nuclear localization by pheromone signaling and the cell cycle. J Cell Biol. 2009;184:409-22 pubmed publisher
  43. Lu Y, Adegoke O, Nepveu A, Nakayama K, Bedard N, Cheng D, et al. USP19 deubiquitinating enzyme supports cell proliferation by stabilizing KPC1, a ubiquitin ligase for p27Kip1. Mol Cell Biol. 2009;29:547-58 pubmed publisher
  44. Wang H, Westin L, Nong Y, Birnbaum S, Bendor J, Brismar H, et al. Norbin is an endogenous regulator of metabotropic glutamate receptor 5 signaling. Science. 2009;326:1554-7 pubmed publisher
  45. Okada C, Yamashita E, Lee S, Shibata S, Katahira J, Nakagawa A, et al. A high-resolution structure of the pre-microRNA nuclear export machinery. Science. 2009;326:1275-9 pubmed publisher
  46. Das M, Drake T, Wiley D, Buchwald P, Vavylonis D, Verde F. Oscillatory dynamics of Cdc42 GTPase in the control of polarized growth. Science. 2012;337:239-43 pubmed publisher
  47. Prasad R, Longley M, Sharief F, Hou E, Copeland W, Wilson S. Human DNA polymerase theta possesses 5'-dRP lyase activity and functions in single-nucleotide base excision repair in vitro. Nucleic Acids Res. 2009;37:1868-77 pubmed publisher
  48. Kralj J, Hochbaum D, Douglass A, Cohen A. Electrical spiking in Escherichia coli probed with a fluorescent voltage-indicating protein. Science. 2011;333:345-8 pubmed publisher
  49. Mayer A, Heidemann M, Lidschreiber M, Schreieck A, Sun M, Hintermair C, et al. CTD tyrosine phosphorylation impairs termination factor recruitment to RNA polymerase II. Science. 2012;336:1723-5 pubmed publisher
  50. Neubauer C, Gillet R, Kelley A, Ramakrishnan V. Decoding in the absence of a codon by tmRNA and SmpB in the ribosome. Science. 2012;335:1366-9 pubmed publisher
  51. Li Z, Park Y, Marcotte E. A Bacteriophage tailspike domain promotes self-cleavage of a human membrane-bound transcription factor, the myelin regulatory factor MYRF. PLoS Biol. 2013;11:e1001624 pubmed publisher
  52. Qian W, Miki D, Zhang H, Liu Y, Zhang X, Tang K, et al. A histone acetyltransferase regulates active DNA demethylation in Arabidopsis. Science. 2012;336:1445-8 pubmed publisher
  53. Yang J, Zhao T, Goldstein J, Brown M. Inhibition of ghrelin O-acyltransferase (GOAT) by octanoylated pentapeptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:10750-5 pubmed publisher
  54. Hsiao Y, Nakagawa A, Shi Z, Mitani S, Xue D, Yuan H. Crystal structure of CRN-4: implications for domain function in apoptotic DNA degradation. Mol Cell Biol. 2009;29:448-57 pubmed publisher
  55. Diskin R, Scheid J, Marcovecchio P, West A, Klein F, Gao H, et al. Increasing the potency and breadth of an HIV antibody by using structure-based rational design. Science. 2011;334:1289-93 pubmed publisher
  56. Avinoam O, Fridman K, Valansi C, Abutbul I, Zeev-Ben-Mordehai T, Maurer U, et al. Conserved eukaryotic fusogens can fuse viral envelopes to cells. Science. 2011;332:589-92 pubmed publisher
  57. Dickinson D, Nelson W, Weis W. A polarized epithelium organized by beta- and alpha-catenin predates cadherin and metazoan origins. Science. 2011;331:1336-9 pubmed publisher
  58. Fleishman S, Whitehead T, Ekiert D, Dreyfus C, Corn J, Strauch E, et al. Computational design of proteins targeting the conserved stem region of influenza hemagglutinin. Science. 2011;332:816-21 pubmed publisher
  59. Ekiert D, Friesen R, Bhabha G, Kwaks T, Jongeneelen M, Yu W, et al. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science. 2011;333:843-50 pubmed publisher
  60. Shi W, Zhang X, Jiang X, Yuan H, Lee J, Barry C, et al. Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis. Science. 2011;333:1630-2 pubmed publisher
  61. Park H, Hohn M, Umehara T, Guo L, Osborne E, Benner J, et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011;333:1151-4 pubmed publisher
  62. DiTacchio L, Le H, Vollmers C, Hatori M, Witcher M, Secombe J, et al. Histone lysine demethylase JARID1a activates CLOCK-BMAL1 and influences the circadian clock. Science. 2011;333:1881-5 pubmed publisher
  63. Dueber E, Schoeffler A, Lingel A, Elliott J, Fedorova A, Giannetti A, et al. Antagonists induce a conformational change in cIAP1 that promotes autoubiquitination. Science. 2011;334:376-80 pubmed publisher
  64. Armache K, Garlick J, Canzio D, Narlikar G, Kingston R. Structural basis of silencing: Sir3 BAH domain in complex with a nucleosome at 3.0 Å resolution. Science. 2011;334:977-82 pubmed publisher
  65. Wilusz J, Whipple J, Phizicky E, Sharp P. tRNAs marked with CCACCA are targeted for degradation. Science. 2011;334:817-21 pubmed publisher
  66. Stefer S, Reitz S, Wang F, Wild K, Pang Y, Schwarz D, et al. Structural basis for tail-anchored membrane protein biogenesis by the Get3-receptor complex. Science. 2011;333:758-62 pubmed publisher
  67. Copic A, Latham C, Horlbeck M, D'Arcangelo J, Miller E. ER cargo properties specify a requirement for COPII coat rigidity mediated by Sec13p. Science. 2012;335:1359-62 pubmed publisher
  68. Tagliabracci V, Engel J, Wen J, Wiley S, Worby C, Kinch L, et al. Secreted kinase phosphorylates extracellular proteins that regulate biomineralization. Science. 2012;336:1150-3 pubmed publisher
  69. Zalatan J, Coyle S, Rajan S, Sidhu S, Lim W. Conformational control of the Ste5 scaffold protein insulates against MAP kinase misactivation. Science. 2012;337:1218-22 pubmed publisher
  70. Barthelme D, Sauer R. Identification of the Cdc48•20S proteasome as an ancient AAA+ proteolytic machine. Science. 2012;337:843-6 pubmed publisher
  71. Hirota T, Lee J, St John P, Sawa M, Iwaisako K, Noguchi T, et al. Identification of small molecule activators of cryptochrome. Science. 2012;337:1094-7 pubmed publisher
  72. Metcalf W, Griffin B, Cicchillo R, Gao J, Janga S, Cooke H, et al. Synthesis of methylphosphonic acid by marine microbes: a source for methane in the aerobic ocean. Science. 2012;337:1104-7 pubmed publisher
  73. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, HAUER M, Doudna J, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337:816-21 pubmed publisher
  74. Breitsprecher D, Jaiswal R, Bombardier J, Gould C, Gelles J, Goode B. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 2012;336:1164-8 pubmed publisher
  75. McCloskey A, Taniguchi I, Shinmyozu K, Ohno M. hnRNP C tetramer measures RNA length to classify RNA polymerase II transcripts for export. Science. 2012;335:1643-6 pubmed publisher
  76. Diao J, Burré J, Vivona S, Cipriano D, Sharma M, Kyoung M, et al. Native α-synuclein induces clustering of synaptic-vesicle mimics via binding to phospholipids and synaptobrevin-2/VAMP2. elife. 2013;2:e00592 pubmed publisher
  77. Zimmermann I, Marabelli A, Bertozzi C, Sivilotti L, Dutzler R. Inhibition of the prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel ELIC by divalent cations. PLoS Biol. 2012;10:e1001429 pubmed publisher
  78. Walser R, Burke J, Gogvadze E, Bohnacker T, Zhang X, Hess D, et al. PKCβ phosphorylates PI3Kγ to activate it and release it from GPCR control. PLoS Biol. 2013;11:e1001587 pubmed publisher
  79. Yao P, Potdar A, Ray P, Eswarappa S, Flagg A, Willard B, et al. The HILDA complex coordinates a conditional switch in the 3'-untranslated region of the VEGFA mRNA. PLoS Biol. 2013;11:e1001635 pubmed publisher
  80. Beyhan S, Gutiérrez M, Voorhies M, Sil A. A temperature-responsive network links cell shape and virulence traits in a primary fungal pathogen. PLoS Biol. 2013;11:e1001614 pubmed publisher
  81. Tao L, Xie Q, Ding Y, Li S, Peng S, Zhang Y, et al. CAMKII and calcineurin regulate the lifespan of Caenorhabditis elegans through the FOXO transcription factor DAF-16. elife. 2013;2:e00518 pubmed publisher
  82. Polley S, Huang D, Hauenstein A, Fusco A, Zhong X, Vu D, et al. A structural basis for IκB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 2013;11:e1001581 pubmed publisher
  83. Okunuki Y, Usui Y, Kezuka T, Hattori T, Masuko K, Nakamura H, et al. Proteomic surveillance of retinal autoantigens in endogenous uveitis: implication of esterase D and brain-type creatine kinase as novel autoantigens. Mol Vis. 2008;14:1094-104 pubmed
  84. Huang N, Chelliah Y, Shan Y, Taylor C, Yoo S, PARTCH C, et al. Crystal structure of the heterodimeric CLOCK:BMAL1 transcriptional activator complex. Science. 2012;337:189-94 pubmed publisher
  85. Iwig J, Vercoulen Y, Das R, Barros T, Limnander A, Che Y, et al. Structural analysis of autoinhibition in the Ras-specific exchange factor RasGRP1. elife. 2013;2:e00813 pubmed publisher
  86. Depuydt M, Leonard S, Vertommen D, Denoncin K, Morsomme P, Wahni K, et al. A periplasmic reducing system protects single cysteine residues from oxidation. Science. 2009;326:1109-11 pubmed publisher
  87. Lu W, Du J, Wacker T, Gerbig-Smentek E, Andrade S, Einsle O. pH-dependent gating in a FocA formate channel. Science. 2011;332:352-4 pubmed publisher
  88. Puel A, Cypowyj S, Bustamante J, Wright J, Liu L, Lim H, et al. Chronic mucocutaneous candidiasis in humans with inborn errors of interleukin-17 immunity. Science. 2011;332:65-8 pubmed publisher
  89. Dunkle J, Wang L, Feldman M, Pulk A, Chen V, Kapral G, et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 2011;332:981-4 pubmed publisher
  90. Login F, Balmand S, Vallier A, Vincent-Monegat C, Vigneron A, Weiss-Gayet M, et al. Antimicrobial peptides keep insect endosymbionts under control. Science. 2011;334:362-5 pubmed publisher
  91. Du J, Zhou Y, Su X, Yu J, Khan S, Jiang H, et al. Sirt5 is a NAD-dependent protein lysine demalonylase and desuccinylase. Science. 2011;334:806-9 pubmed publisher
  92. King N, Sheffler W, Sawaya M, Vollmar B, Sumida J, Andre I, et al. Computational design of self-assembling protein nanomaterials with atomic level accuracy. Science. 2012;336:1171-4 pubmed publisher
  93. Hawley S, Fullerton M, Ross F, Schertzer J, Chevtzoff C, Walker K, et al. The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase. Science. 2012;336:918-22 pubmed publisher
  94. Gagnon M, Seetharaman S, Bulkley D, Steitz T. Structural basis for the rescue of stalled ribosomes: structure of YaeJ bound to the ribosome. Science. 2012;335:1370-2 pubmed publisher
  95. Laganowsky A, Liu C, Sawaya M, Whitelegge J, Park J, Zhao M, et al. Atomic view of a toxic amyloid small oligomer. Science. 2012;335:1228-31 pubmed publisher
  96. Lazarus J, Moughamian A, Tokito M, Holzbaur E. Dynactin subunit p150(Glued) is a neuron-specific anti-catastrophe factor. PLoS Biol. 2013;11:e1001611 pubmed publisher
  97. Castillo-Acosta V, Ruiz-Perez L, Yang W, Gonzalez-Pacanowska D, Vidal A. Identification of a residue critical for the excision of 3'-blocking ends in apurinic/apyrimidinic endonucleases of the Xth family. Nucleic Acids Res. 2009;37:1829-42 pubmed publisher
  98. Yi C, Ma M, Ran L, Zheng J, Tong J, Zhu J, et al. Function and molecular mechanism of acetylation in autophagy regulation. Science. 2012;336:474-7 pubmed publisher
  99. Schulz S, Iglesias-Cans M, Krah A, Yildiz O, Leone V, Matthies D, et al. A new type of Na(+)-driven ATP synthase membrane rotor with a two-carboxylate ion-coupling motif. PLoS Biol. 2013;11:e1001596 pubmed publisher
  100. Ranson-Olson B, Zeilstra-Ryalls J. Regulation of the Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 hemA gene by PrrA and FnrL. J Bacteriol. 2008;190:6769-78 pubmed publisher
  101. Liu W, Chun E, Thompson A, Chubukov P, Xu F, KATRITCH V, et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 2012;337:232-6 pubmed publisher
  102. Colombo M, Bourhis J, Chamontin C, Soriano C, Villet S, Costanzo S, et al. The interaction between the measles virus nucleoprotein and the Interferon Regulator Factor 3 relies on a specific cellular environment. Virol J. 2009;6:59 pubmed publisher
  103. Miyagawa Y, Okita H, Itagaki M, Toyoda M, Katagiri Y, Fujimoto J, et al. EWS/ETS regulates the expression of the Dickkopf family in Ewing family tumor cells. PLoS ONE. 2009;4:e4634 pubmed publisher
  104. Tomishige N, Kumagai K, Kusuda J, Nishijima M, Hanada K. Casein kinase I{gamma}2 down-regulates trafficking of ceramide in the synthesis of sphingomyelin. Mol Biol Cell. 2009;20:348-57 pubmed publisher
  105. Oldham M, Chen J. Crystal structure of the maltose transporter in a pretranslocation intermediate state. Science. 2011;332:1202-5 pubmed publisher
  106. Neunuebel M, Chen Y, Gaspar A, Backlund P, Yergey A, Machner M. De-AMPylation of the small GTPase Rab1 by the pathogen Legionella pneumophila. Science. 2011;333:453-6 pubmed publisher
  107. Xu F, Wu H, KATRITCH V, Han G, Jacobson K, Gao Z, et al. Structure of an agonist-bound human A2A adenosine receptor. Science. 2011;332:322-7 pubmed publisher
  108. Paige J, Wu K, Jaffrey S. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 2011;333:642-6 pubmed publisher
  109. Meister S, Plouffe D, Kuhen K, Bonamy G, Wu T, Barnes S, et al. Imaging of Plasmodium liver stages to drive next-generation antimalarial drug discovery. Science. 2011;334:1372-7 pubmed publisher
  110. Inamori K, Yoshida-Moriguchi T, Hara Y, Anderson M, Yu L, Campbell K. Dystroglycan function requires xylosyl- and glucuronyltransferase activities of LARGE. Science. 2012;335:93-6 pubmed publisher
  111. Brohawn S, del Mármol J, MacKinnon R. Crystal structure of the human K2P TRAAK, a lipid- and mechano-sensitive K+ ion channel. Science. 2012;335:436-41 pubmed publisher
  112. Suzuki G, Shimazu N, Tanaka M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 2012;336:355-9 pubmed publisher
  113. Org T, Chignola F, Hetényi C, Gaetani M, Rebane A, Liiv I, et al. The autoimmune regulator PHD finger binds to non-methylated histone H3K4 to activate gene expression. EMBO Rep. 2008;9:370-6 pubmed publisher
  114. McClelland M, Zhao L, Carskadon S, Arenberg D. Expression of CD74, the receptor for macrophage migration inhibitory factor, in non-small cell lung cancer. Am J Pathol. 2009;174:638-46 pubmed publisher
  115. Oyama S, Yamakawa H, Sasagawa N, Hosoi Y, Futai E, Ishiura S. Dysbindin-1, a schizophrenia-related protein, functionally interacts with the DNA- dependent protein kinase complex in an isoform-dependent manner. PLoS ONE. 2009;4:e4199 pubmed publisher
  116. Ray A, James M, Larochelle S, Fisher R, Blain S. p27Kip1 inhibits cyclin D-cyclin-dependent kinase 4 by two independent modes. Mol Cell Biol. 2009;29:986-99 pubmed publisher
  117. Miller A, Long S. Crystal structure of the human two-pore domain potassium channel K2P1. Science. 2012;335:432-6 pubmed publisher
  118. Wang Y, Ladunga I, Miller A, Horken K, Plucinak T, Weeks D, et al. The small ubiquitin-like modifier (SUMO) and SUMO-conjugating system of Chlamydomonas reinhardtii. Genetics. 2008;179:177-92 pubmed publisher
  119. Scholler N, Gross J, Garvik B, Wells L, Liu Y, Loch C, et al. Use of cancer-specific yeast-secreted in vivo biotinylated recombinant antibodies for serum biomarker discovery. J Transl Med. 2008;6:41 pubmed publisher
  120. Houshmandi S, Emnett R, Giovannini M, Gutmann D. The neurofibromatosis 2 protein, merlin, regulates glial cell growth in an ErbB2- and Src-dependent manner. Mol Cell Biol. 2009;29:1472-86 pubmed publisher
  121. Rousseau A, McEwen A, Poussin-Courmontagne P, Rognan D, Nominé Y, Rio M, et al. TRAF4 is a novel phosphoinositide-binding protein modulating tight junctions and favoring cell migration. PLoS Biol. 2013;11:e1001726 pubmed publisher
  122. Szabo I, Bock J, Grassme H, Soddemann M, Wilker B, Lang F, et al. Mitochondrial potassium channel Kv1.3 mediates Bax-induced apoptosis in lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:14861-6 pubmed publisher
  123. Ramachandran A, Parisien J, Horvath C. STAT2 is a primary target for measles virus V protein-mediated alpha/beta interferon signaling inhibition. J Virol. 2008;82:8330-8 pubmed publisher
  124. Bereczki O, Ujfaludi Z, Pardi N, Nagy Z, Tora L, Boros I, et al. TATA binding protein associated factor 3 (TAF3) interacts with p53 and inhibits its function. BMC Mol Biol. 2008;9:57 pubmed publisher
  125. Zhou B, Liu J, Wang Q, Liu X, Li X, Li P, et al. The nucleocapsid protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus inhibits cell cytokinesis and proliferation by interacting with translation elongation factor 1alpha. J Virol. 2008;82:6962-71 pubmed publisher
  126. Sonnberg S, Seet B, Pawson T, Fleming S, Mercer A. Poxvirus ankyrin repeat proteins are a unique class of F-box proteins that associate with cellular SCF1 ubiquitin ligase complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:10955-60 pubmed publisher
  127. Epting C, King F, Pedersen A, Zaman J, Ritner C, Bernstein H. Stem cell antigen-1 localizes to lipid microdomains and associates with insulin degrading enzyme in skeletal myoblasts. J Cell Physiol. 2008;217:250-60 pubmed publisher
  128. Kodani A, Kristensen I, Huang L, Sutterlin C. GM130-dependent control of Cdc42 activity at the Golgi regulates centrosome organization. Mol Biol Cell. 2009;20:1192-200 pubmed publisher
  129. Conover G, Henderson S, Gregorio C. A myopathy-linked desmin mutation perturbs striated muscle actin filament architecture. Mol Biol Cell. 2009;20:834-45 pubmed publisher
  130. Lee K, Qian D, Rey S, Wei H, Liu J, Semenza G. Anthracycline chemotherapy inhibits HIF-1 transcriptional activity and tumor-induced mobilization of circulating angiogenic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:2353-8 pubmed publisher
  131. Beauvais D, Ell B, McWhorter A, Rapraeger A. Syndecan-1 regulates alphavbeta3 and alphavbeta5 integrin activation during angiogenesis and is blocked by synstatin, a novel peptide inhibitor. J Exp Med. 2009;206:691-705 pubmed publisher
  132. Hata K, Kaibuchi K, Inagaki S, Yamashita T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 2009;184:737-50 pubmed publisher
  133. Kouzu-Fujita M, Mezaki Y, Sawatsubashi S, Matsumoto T, Yamaoka I, Yano T, et al. Coactivation of estrogen receptor beta by gonadotropin-induced cofactor GIOT-4. Mol Cell Biol. 2009;29:83-92 pubmed publisher
  134. Trojer P, Zhang J, Yonezawa M, Schmidt A, Zheng H, Jenuwein T, et al. Dynamic Histone H1 Isotype 4 Methylation and Demethylation by Histone Lysine Methyltransferase G9a/KMT1C and the Jumonji Domain-containing JMJD2/KDM4 Proteins. J Biol Chem. 2009;284:8395-405 pubmed publisher
  135. Gibbs S, Barren B, Beck K, Proft J, Zhao X, Noskova T, et al. Hsp40 couples with the CSPalpha chaperone complex upon induction of the heat shock response. PLoS ONE. 2009;4:e4595 pubmed publisher
  136. MacPherson M, Beatty L, Zhou W, Du M, Sadowski P. The CTCF insulator protein is posttranslationally modified by SUMO. Mol Cell Biol. 2009;29:714-25 pubmed publisher
  137. Zaitseva L, Cherepanov P, Leyens L, Wilson S, Rasaiyaah J, Fassati A. HIV-1 exploits importin 7 to maximize nuclear import of its DNA genome. Retrovirology. 2009;6:11 pubmed publisher
  138. Yuksek K, Chen W, Chien D, Ou J. Ubiquitin-independent degradation of hepatitis C virus F protein. J Virol. 2009;83:612-21 pubmed publisher
  139. Wang H, den Hollander A, Moayedi Y, Abulimiti A, Li Y, Collin R, et al. Mutations in SPATA7 cause Leber congenital amaurosis and juvenile retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 2009;84:380-7 pubmed publisher
  140. Viiri K, Jänis J, Siggers T, Heinonen T, Valjakka J, Bulyk M, et al. DNA-binding and -bending activities of SAP30L and SAP30 are mediated by a zinc-dependent module and monophosphoinositides. Mol Cell Biol. 2009;29:342-56 pubmed publisher
  141. Su J, Takeda K, Tamura S, Fujiki Y, Miki K. Crystal structure of the conserved N-terminal domain of the peroxisomal matrix protein import receptor, Pex14p. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:417-21 pubmed publisher
  142. Salahudeen A, Thompson J, Ruiz J, Ma H, Kinch L, Li Q, et al. An E3 ligase possessing an iron-responsive hemerythrin domain is a regulator of iron homeostasis. Science. 2009;326:722-6 pubmed publisher
  143. Fine B, Hodakoski C, Koujak S, Su T, Saal L, Maurer M, et al. Activation of the PI3K pathway in cancer through inhibition of PTEN by exchange factor P-REX2a. Science. 2009;325:1261-5 pubmed publisher
  144. Sims R, Rojas L, Beck D, Bonasio R, Schüller R, Drury W, et al. The C-terminal domain of RNA polymerase II is modified by site-specific methylation. Science. 2011;332:99-103 pubmed publisher
  145. Zhang K, Fischer T, Porter R, Dhakshnamoorthy J, Zofall M, Zhou M, et al. Clr4/Suv39 and RNA quality control factors cooperate to trigger RNAi and suppress antisense RNA. Science. 2011;331:1624-7 pubmed publisher
  146. Amato S, Liu X, Zheng B, Cantley L, Rakic P, Man H. AMP-activated protein kinase regulates neuronal polarization by interfering with PI 3-kinase localization. Science. 2011;332:247-51 pubmed publisher
  147. Oakhill J, Steel R, Chen Z, Scott J, Ling N, Tam S, et al. AMPK is a direct adenylate charge-regulated protein kinase. Science. 2011;332:1433-5 pubmed publisher
  148. Long D, Raschle M, Joukov V, Walter J. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 2011;333:84-7 pubmed publisher
  149. Hoffmeyer K, Raggioli A, Rudloff S, Anton R, Hierholzer A, Del Valle I, et al. Wnt/β-catenin signaling regulates telomerase in stem cells and cancer cells. Science. 2012;336:1549-54 pubmed publisher
  150. Bagijn M, Goldstein L, Sapetschnig A, Weick E, Bouasker S, Lehrbach N, et al. Function, targets, and evolution of Caenorhabditis elegans piRNAs. Science. 2012;337:574-8 pubmed publisher
  151. Carlton J, Caballe A, Agromayor M, Kloc M, Martin-Serrano J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 2012;336:220-5 pubmed publisher
  152. Xiong B, Bayat V, Jaiswal M, Zhang K, Sandoval H, Charng W, et al. Crag is a GEF for Rab11 required for rhodopsin trafficking and maintenance of adult photoreceptor cells. PLoS Biol. 2012;10:e1001438 pubmed publisher
  153. Bujalka H, Koenning M, Jackson S, Perreau V, Pope B, Hay C, et al. MYRF is a membrane-associated transcription factor that autoproteolytically cleaves to directly activate myelin genes. PLoS Biol. 2013;11:e1001625 pubmed publisher
  154. Robles M, Boyault C, Knutti D, Padmanabhan K, Weitz C. Identification of RACK1 and protein kinase Calpha as integral components of the mammalian circadian clock. Science. 2010;327:463-6 pubmed publisher
  155. Johnson K, Zhu S, Tremblay M, Payette J, Wang J, Bouchez L, et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 2012;336:717-21 pubmed publisher
  156. de Jesus Perez V, Alastalo T, Wu J, Axelrod J, Cooke J, Amieva M, et al. Bone morphogenetic protein 2 induces pulmonary angiogenesis via Wnt-beta-catenin and Wnt-RhoA-Rac1 pathways. J Cell Biol. 2009;184:83-99 pubmed publisher
  157. Mei Y, Zhang Y, Yamamoto K, Xie W, Mak T, You H. FOXO3a-dependent regulation of Pink1 (Park6) mediates survival signaling in response to cytokine deprivation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:5153-8 pubmed publisher
  158. Misawa T, Arima K, Mizusawa H, Satoh J. Close association of water channel AQP1 with amyloid-beta deposition in Alzheimer disease brains. Acta Neuropathol. 2008;116:247-60 pubmed publisher
  159. Matsuyama M, Aizawa S, Shimono A. Sfrp controls apicobasal polarity and oriented cell division in developing gut epithelium. PLoS Genet. 2009;5:e1000427 pubmed publisher
  160. Sathish N, Zhu F, Yuan Y. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF45 interacts with kinesin-2 transporting viral capsid-tegument complexes along microtubules. PLoS Pathog. 2009;5:e1000332 pubmed publisher
  161. Wang F, Tong Q. SIRT2 suppresses adipocyte differentiation by deacetylating FOXO1 and enhancing FOXO1's repressive interaction with PPARgamma. Mol Biol Cell. 2009;20:801-8 pubmed publisher
  162. Wang F, He L, Huangyang P, Liang J, Si W, Yan R, et al. JMJD6 promotes colon carcinogenesis through negative regulation of p53 by hydroxylation. PLoS Biol. 2014;12:e1001819 pubmed publisher
  163. Duong H, Robles M, Knutti D, Weitz C. A molecular mechanism for circadian clock negative feedback. Science. 2011;332:1436-9 pubmed publisher
  164. He Y, Li B, Li Z, Liu P, Wang Y, Tang Q, et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 2011;333:1303-7 pubmed publisher
  165. Naidu S, Friedrich J, Russell J, Zomerdijk J. TAF1B is a TFIIB-like component of the basal transcription machinery for RNA polymerase I. Science. 2011;333:1640-2 pubmed publisher
  166. Chakraborty A, Wang D, Ebright Y, Korlann Y, Kortkhonjia E, Kim T, et al. Opening and closing of the bacterial RNA polymerase clamp. Science. 2012;337:591-5 pubmed publisher
  167. Yi W, Clark P, Mason D, Keenan M, Hill C, Goddard W, et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 2012;337:975-80 pubmed publisher
  168. Moin S, Urban S. Membrane immersion allows rhomboid proteases to achieve specificity by reading transmembrane segment dynamics. elife. 2012;1:e00173 pubmed publisher
  169. Lee B, Moon J, Shu J, Yuan L, Newman Z, Schekman R, et al. UNC93B1 mediates differential trafficking of endosomal TLRs. elife. 2013;2:e00291 pubmed publisher
  170. Wild P, Farhan H, McEwan D, Wagner S, Rogov V, Brady N, et al. Phosphorylation of the autophagy receptor optineurin restricts Salmonella growth. Science. 2011;333:228-33 pubmed publisher
  171. Seth D, Hausladen A, Wang Y, Stamler J. Endogenous protein S-Nitrosylation in E. coli: regulation by OxyR. Science. 2012;336:470-3 pubmed publisher
  172. Kaiser C, Goldman D, Chodera J, Tinoco I, Bustamante C. The ribosome modulates nascent protein folding. Science. 2011;334:1723-7 pubmed publisher
  173. Zhang M, Wu P, Kelly F, Nurse P, Hang H. Quantitative control of protein S-palmitoylation regulates meiotic entry in fission yeast. PLoS Biol. 2013;11:e1001597 pubmed publisher
  174. Previs M, Beck Previs S, Gulick J, Robbins J, Warshaw D. Molecular mechanics of cardiac myosin-binding protein C in native thick filaments. Science. 2012;337:1215-8 pubmed publisher
  175. Mao Z, Hine C, Tian X, Van Meter M, Au M, Vaidya A, et al. SIRT6 promotes DNA repair under stress by activating PARP1. Science. 2011;332:1443-6 pubmed publisher
  176. Coles C, Shen Y, Tenney A, Siebold C, Sutton G, Lu W, et al. Proteoglycan-specific molecular switch for RPTPσ clustering and neuronal extension. Science. 2011;332:484-8 pubmed publisher
  177. Wu X, Zhou T, Zhu J, Zhang B, Georgiev I, Wang C, et al. Focused evolution of HIV-1 neutralizing antibodies revealed by structures and deep sequencing. Science. 2011;333:1593-602 pubmed publisher
  178. Pinheiro V, Taylor A, Cozens C, Abramov M, Renders M, Zhang S, et al. Synthetic genetic polymers capable of heredity and evolution. Science. 2012;336:341-4 pubmed publisher
  179. Wu C, Li T, Farh L, Lin L, Lin T, Yu Y, et al. Structural basis of type II topoisomerase inhibition by the anticancer drug etoposide. Science. 2011;333:459-62 pubmed publisher
  180. Carter A, Cho C, Jin L, Vale R. Crystal structure of the dynein motor domain. Science. 2011;331:1159-65 pubmed publisher
  181. Farcas A, Blackledge N, Sudbery I, Long H, McGouran J, Rose N, et al. KDM2B links the Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) to recognition of CpG islands. elife. 2012;1:e00205 pubmed publisher
  182. Schopfer P, Heyno E, Drepper F, Krieger-Liszkay A. Naphthoquinone-dependent generation of superoxide radicals by quinone reductase isolated from the plasma membrane of soybean. Plant Physiol. 2008;147:864-78 pubmed publisher
  183. Nakane S, Nakagawa N, Kuramitsu S, Masui R. Characterization of DNA polymerase X from Thermus thermophilus HB8 reveals the POLXc and PHP domains are both required for 3'-5' exonuclease activity. Nucleic Acids Res. 2009;37:2037-52 pubmed publisher
  184. Oganesyan V, Damschroder M, Cook K, Wu H, Dall'Acqua W. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the complex between a human anti-interferon antibody fragment and human interferon alpha-2A. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2009;65:14-6 pubmed publisher
  185. Guo Y, Nady N, Qi C, Allali-Hassani A, Zhu H, Pan P, et al. Methylation-state-specific recognition of histones by the MBT repeat protein L3MBTL2. Nucleic Acids Res. 2009;37:2204-10 pubmed publisher
  186. Müller M, Peters H, Blümer J, Blankenfeldt W, Goody R, Itzen A. The Legionella effector protein DrrA AMPylates the membrane traffic regulator Rab1b. Science. 2010;329:946-9 pubmed publisher
  187. Azoitei M, Correia B, Ban Y, Carrico C, Kalyuzhniy O, Chen L, et al. Computation-guided backbone grafting of a discontinuous motif onto a protein scaffold. Science. 2011;334:373-6 pubmed publisher
  188. Dey A, Seshasayee D, Noubade R, French D, Liu J, Chaurushiya M, et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 2012;337:1541-6 pubmed
  189. Ayaz P, Ye X, Huddleston P, Brautigam C, Rice L. A TOG:αβ-tubulin complex structure reveals conformation-based mechanisms for a microtubule polymerase. Science. 2012;337:857-60 pubmed publisher
  190. Gao Y, Zorman S, Gundersen G, Xi Z, Ma L, Sirinakis G, et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 2012;337:1340-3 pubmed publisher
  191. Liu T, Liu Z, Song C, Hu Y, Han Z, She J, et al. Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor. Science. 2012;336:1160-4 pubmed publisher
  192. Janda C, Waghray D, Levin A, Thomas C, Garcia K. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 2012;337:59-64 pubmed publisher
  193. Polikanov Y, Blaha G, Steitz T. How hibernation factors RMF, HPF, and YfiA turn off protein synthesis. Science. 2012;336:915-8 pubmed publisher
  194. Kudryashev M, Stenta M, Schmelz S, Amstutz M, Wiesand U, Castaño-Diez D, et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. elife. 2013;2:e00792 pubmed publisher
  195. Andersen K, Onischenko E, Tang J, Kumar P, Chen J, Ulrich A, et al. Scaffold nucleoporins Nup188 and Nup192 share structural and functional properties with nuclear transport receptors. elife. 2013;2:e00745 pubmed publisher
  196. Pallesen J, Hashem Y, Korkmaz G, Koripella R, Huang C, Ehrenberg M, et al. Cryo-EM visualization of the ribosome in termination complex with apo-RF3 and RF1. elife. 2013;2:e00411 pubmed publisher
  197. Gong L, Suchard M, Bloom J. Stability-mediated epistasis constrains the evolution of an influenza protein. elife. 2013;2:e00631 pubmed publisher
  198. Liu X, Bushnell D, Silva D, Huang X, Kornberg R. Initiation complex structure and promoter proofreading. Science. 2011;333:633-7 pubmed publisher
  199. Soon F, Ng L, Zhou X, West G, Kovach A, Tan M, et al. Molecular mimicry regulates ABA signaling by SnRK2 kinases and PP2C phosphatases. Science. 2012;335:85-8 pubmed publisher
  200. Gari K, León Ortiz A, Borel V, Flynn H, Skehel J, Boulton S. MMS19 links cytoplasmic iron-sulfur cluster assembly to DNA metabolism. Science. 2012;337:243-5 pubmed publisher
  201. van den Elsen J, Isenman D. A crystal structure of the complex between human complement receptor 2 and its ligand C3d. Science. 2011;332:608-11 pubmed publisher
  202. Cooley R, Rhoads T, Arp D, Karplus P. A diiron protein autogenerates a valine-phenylalanine cross-link. Science. 2011;332:929 pubmed publisher
  203. Klinge S, Voigts-Hoffmann F, Leibundgut M, Arpagaus S, Ban N. Crystal structure of the eukaryotic 60S ribosomal subunit in complex with initiation factor 6. Science. 2011;334:941-8 pubmed publisher
  204. Lecona E, Rojas L, Bonasio R, Johnston A, Fernandez-Capetillo O, Reinberg D. Polycomb protein SCML2 regulates the cell cycle by binding and modulating CDK/CYCLIN/p21 complexes. PLoS Biol. 2013;11:e1001737 pubmed publisher
  205. Zcharia E, Jia J, Zhang X, Baraz L, Lindahl U, Peretz T, et al. Newly generated heparanase knock-out mice unravel co-regulation of heparanase and matrix metalloproteinases. PLoS ONE. 2009;4:e5181 pubmed publisher
  206. Roostalu J, Hentrich C, Bieling P, Telley I, Schiebel E, Surrey T. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 2011;332:94-9 pubmed publisher
  207. Peng T, Huang B, Sun Y, Lu Y, Bonewald L, Chen S, et al. Blocking of proteolytic processing and deletion of glycosaminoglycan side chain of mouse DMP1 by substituting critical amino acid residues. Cells Tissues Organs. 2009;189:192-7 pubmed publisher
  208. Ataide S, Schmitz N, Shen K, Ke A, Shan S, Doudna J, et al. The crystal structure of the signal recognition particle in complex with its receptor. Science. 2011;331:881-6 pubmed publisher
  209. Spatzal T, Aksoyoglu M, Zhang L, Andrade S, Schleicher E, Weber S, et al. Evidence for interstitial carbon in nitrogenase FeMo cofactor. Science. 2011;334:940 pubmed publisher
  210. Zhang S, Bryant D. The tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria. Science. 2011;334:1551-3 pubmed publisher
  211. Gardner B, Walter P. Unfolded proteins are Ire1-activating ligands that directly induce the unfolded protein response. Science. 2011;333:1891-4 pubmed publisher
  212. McNulty N, Wu M, Erickson A, Pan C, Erickson B, Martens E, et al. Effects of diet on resource utilization by a model human gut microbiota containing Bacteroides cellulosilyticus WH2, a symbiont with an extensive glycobiome. PLoS Biol. 2013;11:e1001637 pubmed publisher
ISSN : 2329-5139