Protein Modification Research Methods
Mary Johnson (mary at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Перевод
Константин Якимчук (Konstantin dot Yakimchuk at ki dot se)
Каролинский институт, Швеция
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.2.118
Дата
последнего обновления : 2015-03-11; оригинальная версия : 2012-04-09
Цитировать как
MATER METHODS ru 2012;2:118
English Abstract

The article provides a summary of protein modifications from UniProt database and an overview of research methods for major protein modifications: phosphorylation, acetylation and methylation, ubiquitination, and glycosylation.

Геном человека содержит 23000 генов, однако, эти гены генерируют значительно больший протеом. Это связано с диверсификацией на пост-транскрипционном и пост-трансляционном уровнях. После транскрипции, множественные молекулы мРНК могут быть получены из одного гена с помощью альтернативного сплайсинга и, менее часто, на стадии редактирования. В процессе трансляции многие белки подвергаются модификации и/ или расщеплению для получения зрелых и функциональных форм. Структура и функции белков различны вследствие широкого спектра пост-трансляционных модификаций. Статус и структура модификации белка позволяет выявить различные функции белков в различных клетках или в течение определенного этапа развития, а также нарушения регуляции функции при заболеваниях. В этом обзоре обсуждаются четыре основных типа белковых модификаций: фосфорилирование, ацетилирование и метилирование, убиквитинирование, гликозилирование и их общие методы исследования.

Введение

Протеом человека состоит из значительно большего количества функциональных полипептидов, чем набор генов в геноме, что объясняется, в частности, модификациями белков во время и после трансляции (рис. 1А). Протеомные исследования стремятся получить полное представление о функциональных белках, присутствующих в определённых типах клеток или тканей, в здоровых или больных тканях. Важной задачей протеомных исследований является выявление тех белков, которые пост-трансляционно модифицированы, и их модифицированных участков и характеризация функций модификаций и взаимодействия модифицированного белка в пределах функциональной клеточной сети.

Protein Modification Research Methods Рисунок 1
Рисунок 1. Белковые модификации. A, Пост-трансляционные модификации в сочетании с альтернативным сплайсингом играют важную роль в генерации нескольких функциональных белков из одного гена. B, Пост-трансляционные модификации играют важную роль в различных клеточных функциях, таких как внутриклеточная сигнализация (фосфорилирование), регулирование стабильности белка (убиквитинирование), регуляция транскрипции (ацетилирование и метилирование гистонов) и сигнализация в клеточной мембране (гликозилирование).

В течение последних десятилетий было разработано несколько методов анализа белковых модификаций. В этом обзоре мы рассмотрим масс-спектрометрию как метод общего подхода к определению модификаций белков и специфичных методов фосфорилирования, таких как маркирование ортофосфатом, убиквитинирование, ацетилирование гистонов и метилирование в контексте ремоделирования хроматина и гликозилирование белков (табл. 1 и рис. 1В). Подробные протоколы в этом обзоре не описаны, и будут представлены позже.

модификацияфункцияметод
ФосфорилированиеВнутриклеточные сигналы
  • Масс-спектрометрия
  • Радиометрический анализ
  • Вестерн-блоттинг с использованием фосфоспецифичных антител
УбиквинированиеДеградация белка
  • Масс-спектрометрия
  • Анализ убиквинирования
Ацетилирование и метилированиеРегуляция транскрипции
  • ChIP
  • ChIP-on-chip
ГликозилированиеВнеклеточные сигналы
  • Масс-спектрометрия
  • HPLC
Таблица 1. Типы белковых модификаций, их основные клеточные функции и основные методы исследования.

Основным предварительным подходом к выявлению новых участков модификации является анализ in silico Компьютерные программы, которые идентифицируют предполагаемые модификационные участки на основе структурных последовательностей были широко использованы, но находятся за рамками данного обзора. Отличный обзор компьютерных программ был представлен Liu и Li, 2011 [6].

Масс-спектрометрия

За последние 20 лет, масс-спектрометрический анализ стал важным инструментом для определения видов и участков белковых модификаций. Масс-спектрометрический анализ может быть выполнен как для очищенных белков, так и для смеси белков, например, клеточных лизатов [7, 8].

Масс-спектрометр генерирует газофазные ионы из образца, отделяет их в зависимости от отношения их массы к заряду (м/з) и регистрирует их распространённость. Масс-спектрометрия может быть использована для определения молекулярной массы пептидов и белков, для определения аминокислотной последовательности пептидов, а также для обнаружения пост-трансляционных модификаций и относительного подсчёта количества пептидов и белков. Этот метод не может быть использован для абсолютного количественного определения.

Для приготовления образца для масс-спектрометрического анализа, белок или лизат расщепляется до получения небольших пептидных фрагментов с использованием рестрикционных ферментов, таких как трипсин. Фрагменты затем высушиваются и анализируются с целью определения их м/з соотношения. Затем, поскольку специфичные участки для рестрикционных ферментов известны, компьютерная программа определяет уникальную аминокислотную последовательность для каждого пептида на основе массы. Если молекулярная масса и заряд такого участка как фосфатная группа известны, фосфорилирование специфических аминокислот в пептидном фрагменте также может быть оценено.

Образец расщепленного белка может быть проанализирован матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI), пептидным картированием или наноэлектроспрей масс-спектрометрией. Использование этих методов, однако, может привести к неполному результату, при котором некоторые из пептидов хорошо определяются, а другие - нет. Это часто является основной проблемой при анализе сложных смесей, и для модифицированных пептидов и в анализе пост-трансляционных модификаций пептиды сначала подвергаются разделению обратно-фазной хроматографией с последующим сбором фракций и анализом масс-спектрометрией (метод, известный как LC/MS) (рис. 2В) [9]. Для более точного определения характера пептидной модификации часто испрользуется тандемная масс-спектрометрия (МS/МS) (рис. 2А). После первой стадии МS, происходит столкновение пептидных ионов с инертным газом, что приводит к дальнейшей фрагментации. Эти пептидные фрагменты анализируются на втором этапе МS [10]. Некоторые модифицированные пептиды остаются неизменными в ходе этого процесса, создавая картину фрагментации, характерную для немодифицированного пептида, тогда как другие пептиды значительно фрагментируются, создавая картину фрагментации, которая может предоставить дополнительную информацию о характере и расположении модифицированных аминокислот.

Protein Modification Research Methods Рисунок 2
Рисунок 2. Масс-спектрометрия в качестве инструмента для общего анализа белковых модификаций. A, Пептидная ионизация используется в масс-спектрометрическом (MS) анализе для анализа соотношения массы к заряду (м/з) белковых фрагментов. На следующем этапе (в MS/MS анализе) продукты фрагментируются далее для получения дополнительных данных. B, В LC-MS/MS, сложная смесь белков разделяется в жидкой стадии хроматографии (слева), прежде чем быть подвергнутым MS/MS (правая панель) для идентификации отдельных пептидных фрагментов [1].

В дополнение к определению изменения состояния конкретного белка, масс-спектрометрия использовалась для создания обширных баз данных о белках, несущих специфичные модификации, например, фосфорилирование. Это обычно включает отбор по принципу совместимости или родства до масс-спектрометрического анализа. Эти методы используются для определения суб-протеома, несущего эту модификацию, такого как фосфопротеом для анализа состояния активации сигнальных путей, например при раке [11].

Масс-спектрометрия может быть использована для идентификации всех четырех вышеупомянутых модификаций. Тем не менее, масс-спектрометрический анализ является более дорогостоящим и требует специального оборудования и, зачастую, больше количественных данных. Другие биохимические методы часто используются в сочетании с масс-спектрометрией для анализа пост-трансляционных модификаций. Более обширный обзор многочисленных MS методов доступен в [7], [8].

Фосфорилирование

Фосфорилирование или добавление фосфатной группы к серину, треонину или тирозину является одной из наиболее распространенных форм модификации белков (рис. 3А). Фосфорилирование белков играет важную роль во внутриклеточных сигнальных каскадах и, обратимо, в сигнальной регуляции [12]. Несколько методов in vivo и in vitro используются для оценки степени фосфорилирования белков, с целью оценки фосфорилирования конкретных аминокислот и установления степени модификации белка конкретной киназой (или фосфатазой).

Protein Modification Research Methods Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ фосфорилирования белка на основе методов, использующих антитела. A, В результате фосфорилирования фосфатная группа добавляется к остатку серина, треонина или тирозина. Эта фосфатная группа может быть использована в качестве маркера или при помощи радиоактивного фосфата для радиометрического анализа, или в методе, использующим антитела, специфично связывающиеся с фосфорилированной аминокислотой. B, Метод анализа фосфорилирования in vivo демонстрирует фосфорилирование TH1 последством с-Src. Эти два белка эктопически экспрессируются, выполняется иммунопреципитация для определения Myc-меченого TH1, и антитела к фосфотирозину используются для оценки TH1 фосфорилирования в присутствии или отсутствие экспрессии с-Src [2].
Анализ фосфорилирования методом in vitro

Радиометрические реакции киназы, использующие 32Р-гамма-АТФ, могут быть использованы для анализа состояния фосфорилирования in vitro [13]. Это также является золотым стандартом для оценки роли специфичных киназ. Очищенный целевой белок, киназы и 32Р-гамма-АТФ инкубируют в буферном растворе для реакции. Затем реакционный раствор пропускается через фильтр для связывания белка, пропускающий несвязанный АТФ, и уровень фосфорилирования (радиоизотоп удерживается на фильтре) опледеляется с помощью сцинтилляционного счетчика. Альтернативно, реакция может быть осуществлена с помощью SDS-PAGE и визуализирована на рентгеновской пленке. Этот метод является менее количественным, но может подтвердить молекулярную массу фосфорилированного белка .

Кроме того, реакция может включать фосфатазу вместо киназы для определения возможности того, является ли фосфорилированный белок субстратом для конкретной фосфатазы.

Радиоактивное импульсное мечение

Радиоактивное импульсное мечение использовалось для анализа фосфорилирования in vivo [14]. Клетки выращивают в присутствии 32Р-ортофосфата. Затем целевой белок иммунопреципитируется со специфичным антителом, и сохранившийся радиоизотоп определяется количественно с помощью сцинтилляционного счетчика или анализируется с помощью SDS-PAGE и визуализируется на рентгеновской пленке. Этот метод может быть использован для анализа фосфорилирования в различных физиологических условиях. Кроме того, в сочетании с ингибированием экспрессии белка нокдауном гена, этот метод может быть также использован для идентификации конкретной киназы или фосфатазы в модификации белка-мишени.

Фосфо-специфичные антитела

Существует две категории фосфо-специфичных антител. Одна из категорий объединяет анти-фосфо-тирозиновые, анти-фосфо-сериновые и анти-фосфо-треониновые антитела, которые связываются с любыми фосфо-тирозиновыми, фосфо-сериновыми и фосфо-треониновыми аминокислотными участками независимо от соседних аминокислотных остатков. Вторая категория включает антитела к фосфо-специфическим аминокислотным эпитопам.

После идентификации предполагаемого участка фосфорилирования кремниевым методом in silico или методом масс-спектрометрии, коммерчески доступные антитела, реагирующие с общими участками фосфорилирования, могут быть использованы в сочетании с иммунопреципитацией, чтобы определить, фосфорилируется ли белок-мишень в определенном участке или нет (например, канонический циклин/cdk участок) [15]. Антитела, связывающиеся с конкретной фосфорилированной аминокислотой, такой как фосфотирозин, также могут быть использованы (рис. 3В). Следующим этапом может быть генерация фосфо-специфичных антител к специфичному эпитопу и анализ фосфорилирования с помощью простого Вестерн-блоттинга. Для анализа большого количества образцов, может использоваться метод ELISA, при котором субстрат захватывается мембраной и может определяться с помощью фосфо-специфичных антител [16].

Убиквитинирование

Убиквитинирование белков или ковалентное присоединение убиквитина к целевым белкам наиболее изученно в контексте деградации белка. Например, было показано, что изменения белка путём убиквитинирования играют важную роль в стимулировании клеточного цикла [17]. Однако, недавнее исследование также показало роль убиквитинирования в независимых внутриклеточных сигнальных путях, связанных с белковой деградацией.

Разнообразие убиквитин-связанного сигнального пути зависит от многих способов, с помощью которых целевой белок может быть модифицирован путём убиквитинирования-моноубиквитинирования в одном или нескольких участках и полиубиквитинирования через несколько возможных связей [18]. Каждая молекула убиквитина имеет семь возможных остатков лизина, которые могут быть использованы для удлинения цепи, таким образом функциональный исход полиубиквитинирования зависит от остатка лизина, который подвергается убиквитинированию. Это, в свою очередь, определяется специфичным Е2 (убиквитин-связанный фермент) или Е3 (убиквитин-лигаза), но не Е1 (убиквитин-активирующий фермент) (рис. 4А). Образование полиубиквитиновых цепей с определенными связями с лизином создает уникальную связывающую поверхность для специализированных убиквитин-связывающих доменов взаимодействующих белков.

Protein Modification Research Methods Рисунок 4
Рисунок 4. Убиквитинирование белков in vivo и in vitro может быть проанализировано с помощью анализа основанного на вестерн-блоттинге. A, in vivo и in vitro анализ убиквитинирования белков требует присутствия белка-субстрата, E1, E2б E3, АТФ и убиквитина. Убиквитинированный субстрат может быть визуализирован с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. B, В естественных условиях анализ убиквитинирования показывает, что RNF185 является посредником для К63-связанного полиубиквитинирования BNIP1. Субстрат (BNIP1), Е3 (RNF185) и убиквитин экспрессируются эктопически, затем флаг-меченый субстрат иммунопреципитируется и Myc-меченый убиквитин визуализируется с помощью Вестерн-блоттинга [3].

Методы анализа убиквитинирования могут выявить убиквитинирование в определенных остатках лизина или подтвердить роль конкретных E3 или E2 в модификации белка-мишени. Наиболее простым и часто используемым способом оценки убиквитинирования in vivo является иммунопреципитация предположительно убиквитинированного белка и подвергание его SDS-PAGE/ Вестерн-блоттингу с целью обнаружения типичных убиквитинированных белков. Белок-мишень, E3 лигаза, и даже убиквитин часто эктопически экспрессируются для определения эффектов мутаций (рис. 4В). Ингибиторы протеасомальной деградации, такие как MG132, часто используются для анализа в естественных условиях K48 (сфокусированная деградация) убиквитинирования белков-мишеней .

Анализ убиквитинирования in vitro (где присутствуют белок-мишень, убиквитин, E1, E2 и E3) может быть использован в сочетании с SDS-PAGE с последующим Вестерн-блоттингом, для непосредственного анализа убиквитинирования рассматриваемого белка. Мутации остатков лизина в пределах рассматриваемого белка могут быть использованы для определения участка связывания убиквитина. И наоборот, в случае полиубиквитинирования, использование убиквитина с мутациями остатков лизина может предоставить информацию о специфичных связях убиквитина. Для обнаружения новых убиквитинированных белков может быть выполнена убиквитин-связанная очистка белков с последующим масс-спектрометрическим анализом [19].

Ацетилирование и метилирование

Эпигенетические модификации (такие как фосфорилирование, убиквитинирование, ацетилирование и метилирование) консервативных центральных гистонов H2A, H2B, H3 и H4 играют важную регуляторную роль в экспрессии генов [20]. Например, ацетилирование и метилирование остатков лизина на N-конце гистона регулирует формирование доменов хроматина, таких как эухроматин и гетерохроматин, таким образом, непосредственно вызывая блокирование генов. Анализ уровня модификации центральных гистонов являлся важным методом оценки регуляции экспрессии генов [21].

Модифицированные антитела к гистону антител и ChIP

Обширные коллекции антител являются коммерчески доступными для всех известных участков модификации гистонов. С помощью этих антител может быть выполнена иммунопреципитация (ChIP) [22]. Вкратце, клетки или ткани образца обрабатываются фиксирующим реагентом, таким как формальдегид, для перекрестного связываня гистонов хроматина. Хроматин подвергается соникации ультразвуком или обрабатывается нуклеазой для генерации коротких фрагментов ДНК. Затем проводится иммунопреципитация с использованием антител против выбранных модифицированных гистонов. Если предполагаемый участок модификации гистонов в пределах гена или промотора известен, то для количественного определения присутствия модификации в конкретном участке может использоваться полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Рис. 5а). Кроме того, этот способ может быть использован для идентификации участка гистонной модификации в области общего промотора, а также кинетики модификации гистонов в этом участке (рис. 5В).

Protein Modification Research Methods Рисунок 5
Рисунок 5. Ацетилирование и метилирование стержневых гистонов может быть определено иммунопреципитацией хроматина. A, Иммунопреципитация хроматина (ChIP) может быть использована для оценки модификации стержневых гистонов и, следовательно, эпигенетического статуса генов. B, ChIP анализ используется для сужения участков модификации гистонов в более широкой области промоторного участка, а также для анализа кинетики модификации гена fos после TCA лечения. Гистонное метилирование в 3kb области, включая промотор гена fos определяется в течение 4 часов после ТСА лечения [4].
ChIP-on-chip анализ

Если участок гистоновой модификации не известен, ChIP-on-chip анализ может быть выполнен для идентификации участка в геноме, несущего специфичные модификации гистонов [23]. В этой конфигурации фрагменты ДНК в процессе иммунопреципитации помечены разными флюорофорами. Затем образцы пропускают через чип с ДНК пробами, и обогащение данного фрагмента ДНК в иммунопреципитированной фракции коррелирует с локализацией модифицированного гистона в данном участке генома.

Эксперименты ChIP и ChIP-on-chip могут предоставлять информацию о модификации гистонов в специфичном промоторе, кинетике изменения статуса модификации, а также расположение модификации гистонов в отношении гена, или регуляторной последовательности, или всего генома. Эти эпигенетические изменения могут пролить свет на регуляцию генов во время нормального функционирования и нарушения регуляции происходящего во время развития заболевания.

Гликозилирование

Предполагается, что гликозилирование или присоединение одной из большого числа гликановых групп возникает приблизительно у 50% всех белков и играет важную роль в таких разнообразных биологических процессах, как эмбриональное развитие, деление клеток, а также регулирование структуры белка.

Степень гликозилирования широкого спектра белков существенно меняется в течение нормальных физиологических событий, а также при заболеваниях (например, воспаление, сепсис и рак). Таким образом, методы исследования гликозилирования белков могут быть информативными в исследованиях, направленных на прогноз заболевания и проводящихся в терапевтических целях.

Два основных типа гликозилирования белков включают N-гликозилирование (при котором гликан связан с аспарагином) и О-гликозилирование (при котором гликан связан с серином или треонином). Гликозилирование белка отличается от описанных выше модификаций наличием широкого спектра описанных изменений гликанов. Анализ гликозилирования белков направлен на определение группы гликанов, модифицированного белка или участка присоединения. В общем, анализ гликозилирования может быть проведен с использованием трех различных подходов, как указано в рис. 6А: анализа химически или ферментативно выделенных гликанов, характеристики гликопептидов после триптического расщепления или характеристики гликанов в интактных гликопротеинах.

Protein Modification Research Methods Рисунок 6
Рисунок 6. Анализ гликозилирования может проводится методом масс-спектрометрии для определения специфичных модификаций гликанов. A, Гликозилирование может быть проанализировано методом масс-спектрометрии с помощью трёх общих методов: анализа интактного протеогликана, анализа продуктов триптического расщепления или анализом выделенных и изолированных гликанов. B, LS-МS анализ эмбриональной коровьей сыворотки фетуином показывает изменение гликозилирования при инкубации с Cс5 бактериями (нижняя панель) по сравнению с необработанными образцами (верхняя панель). Фетуин был расщеплён трипсином, а затем проанализирован LS-МS. Синие квадраты представляют GlcNAc, красные и зеленые круги – Man и Гал и оранжевые ромбы Sial [5].
Анализ гликана

Масс-спектрометрический анализ может быть использован для анализа гликанов, иногда в сочетании с HPLC. Группы сахаров группы выделяются из гликопротеинов либо ферментативно (пептид N гликозидазы А или F) или химически (гидазинолиз). LS-МS анализ может быть выполнен непосредственно на выделенных олигосахаридах. С другой стороны, редуцирующая терминация производится ферментативным или химическим расщеплением и может быть помечена флюорофорной меткой и гликанами, меченными флюорофором, которые могут быть проанализированы с помощью различных возможных методов HPLC, например HPLC, связанные с гидрофильными взаимодействиями [24].

Идентификация гликопротеина

В то время как методы, описанные выше, обеспечивают информацию о конкретных гликанах, они не являются информативными, когда речь идет об идентификации белка, несущего специфичную модификацию или участка присоединения. Для получения этой информации , используется расщепление эндопротеиназой (например триптическое расщепление) и гликопептиды анализируются с помощью LS/МS или HILIC-MS/MS. Этот метод может предоставлять информацию обо всех белках, несущих специфичный фрагмент гликана или участка данного белка, к которому присоединяется гликан [25]. Например, на рис. 6В, эффект инкубации с CC5 бактерий на гликозилирование специфических участков фетуином анализируют, после триптического расщепления, с помощью LC-МS.

Наконец, для некоторых гликопептидов, исследование интактного белка масс-спектрометрическим анализом может предоставить данные о структуре белка и степени его гликозилирования. Однако, этот метод зависит от биохимических свойств гликопептида и часто обеспечивает более низкий уровень разрешения, чем два описанных выше метода.

Ссылки
  1. Vitek O. Getting started in computational mass spectrometry-based proteomics. PLoS Comput Biol. 2009;5:e1000366 pubmed
  2. Wu W, Sun Z, Wu J, Peng X, Gan H, Zhang C, et al. Trihydrophobin 1 phosphorylation by c-Src regulates MAPK/ERK signaling and cell migration. PLoS ONE. 2012;7:e29920 pubmed publisher
  3. Tang F, Wang B, Li N, Wu Y, Jia J, Suo T, et al. RNF185, a novel mitochondrial ubiquitin E3 ligase, regulates autophagy through interaction with BNIP1. PLoS ONE. 2011;6:e24367 pubmed publisher
  4. Hazzalin C, Mahadevan L. Dynamic acetylation of all lysine 4-methylated histone H3 in the mouse nucleus: analysis at c-fos and c-jun. PLoS Biol. 2005;3:e393 pubmed
  5. Renzi F, Manfredi P, Mally M, Moes S, Jeno P, Cornelis G. The N-glycan glycoprotein deglycosylation complex (Gpd) from Capnocytophaga canimorsus deglycosylates human IgG. PLoS Pathog. 2011;7:e1002118 pubmed publisher
  6. Liu C, Li H. In silico prediction of post-translational modifications. Methods Mol Biol. 2011;760:325-40 pubmed publisher
  7. Mann M, Hendrickson R, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annu Rev Biochem. 2001;70:437-73 pubmed
  8. Domon B, Aebersold R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 2006;312:212-7 pubmed
  9. Korfmacher W. Principles and applications of LC-MS in new drug discovery. Drug Discov Today. 2005;10:1357-67 pubmed
  10. Verbeck G, Ruotolo B, Sawyer H, Gillig K, Russell D. A fundamental introduction to ion mobility mass spectrometry applied to the analysis of biomolecules. J Biomol Tech. 2002;13:56-61 pubmed
  11. Lim Y. Mining the tumor phosphoproteome for cancer markers. Clin Cancer Res. 2005;11:3163-9 pubmed
  12. Cohen P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 2000;25:596-601 pubmed
  13. Hastie C, McLauchlan H, Cohen P. Assay of protein kinases using radiolabeled ATP: a protocol. Nat Protoc. 2006;1:968-71 pubmed
  14. Peck S. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. Plant J. 2006;45:512-22 pubmed
  15. Zhang H, Zha X, Tan Y, Hornbeck P, Mastrangelo A, Alessi D, et al. Phosphoprotein analysis using antibodies broadly reactive against phosphorylated motifs. J Biol Chem. 2002;277:39379-87 pubmed
  16. Blaydes J, Vojtesek B, Bloomberg G, Hupp T. The development and use of phospho-specific antibodies to study protein phosphorylation. Methods Mol Biol. 2000;99:177-89 pubmed
  17. Tyers M, Jorgensen P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 2000;10:54-64 pubmed
  18. Behrends C, Harper J. Constructing and decoding unconventional ubiquitin chains. Nat Struct Mol Biol. 2011;18:520-8 pubmed publisher
  19. Tomlinson E, Palaniyappan N, Tooth D, Layfield R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 2007;7:1016-22 pubmed
  20. 15.
  21. Bartova E, Krejci J, Harnicarová A, Galiova G, Kozubek S. Histone modifications and nuclear architecture: a review. J Histochem Cytochem. 2008;56:711-21 pubmed publisher
  22. Spencer V, Sun J, Li L, Davie J. Chromatin immunoprecipitation: a tool for studying histone acetylation and transcription factor binding. Methods. 2003;31:67-75 pubmed
  23. Buck M, Lieb J. ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments. Genomics. 2004;83:349-60 pubmed
  24. Wuhrer M, Deelder A, Hokke C. Protein glycosylation analysis by liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005;825:124-33 pubmed
  25. Zauner G, Koeleman C, Deelder A, Wuhrer M. Protein glycosylation analysis by HILIC-LC-MS of Proteinase K-generated N- and O-glycopeptides. J Sep Sci. 2010;33:903-10 pubmed publisher
ISSN : 2329-5139