Протеасома ингибиторы
Mary Johnson (mary at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Перевод
Константин Якимчук (Konstantin dot Yakimchuk at ki dot se)
Каролинский институт, Швеция
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.2.133
Дата
последнего обновления : 2015-03-09; оригинальная версия : 2012-10-25
Цитировать как
MATER METHODS ru 2012;2:133
English Abstract

A succinct review of proteasome inhibitors used in proteasome research, and survey result from the literature.

Протеасома и её ингибиторы

Протеасомальная деградация является основным путем деградации белков, в результате которого белки с нарушенной во время синтеза структурой и другие белки подвергаются лизису. Протеасома обнаруживается во всех клетках эукариот, архей и некоторых бактерий. Она является мультикаталитической протеазой, состоящей из нескольких каталитических и регуляторных белков. Протеасома проявляет три или четыре различных типа пептидазной активности, в том числе трипсиноподобную, химотрипсиноподобную и пептидилглутамил-пептидную гидролизную активности. Существуют два типа протеасом различающихся по их коэффициентам седиментации. Протеасома 26S является АТФ-зависимой с молекулярной массой около 2000 кДа, а протеасома 20S является АТФ-независимой с молекулярной массой примерно 750 кДа. Большинство белков подвергаются убиквитинированию до протеасомальной деградации.

Протеасома ингибиторы Рисунок 1
Рисунок 1. Схема структуры убиквитин-протеасомального комплекса. Рисунок предоставлен NIAAA, NIH.

Протеасомальные ингибиторы получили применение в качестве терапевтических препаратов для лечения таких заболеваний, как рак, и широкое применение в научных лабораторных исследованиях. Бортезомиб, который также называется PS-341, Velcade и MG-341, является FDA-одобренным препаратом для лечения множественной миеломы и лимфомы клеток мантии. Он также использовался в лабораторных экспериментах для ингибирования протеасомальной активности [1]. Некоторые другие ингибиторы протеасомы, такие как дисульфирам, эпигаллокатехин-3-галлат, салиноспорамид, карфилзомиб, ONX 0912, CEP-18770 и MLN9708, могут являться полезными лекарственными препаратами или проходят клинические испытания и тестирования.

ингибиторКол-во
обратимый пептидный ингибитор протеасомы MG13222
лактацистин6
протеасомальный ингибитор I2
Таблица 1. Протеасомальные ингибиторы и количество публикаций.

На 16 октября 2012 года Labome проанализировал 10096 статей по использованию антител. Среди тех 10 096 статей, Labome проанализировал приложения всех реагентов (в том числе антител) в 2117 публикациях. Двадцать девять из 2117 статей содержат прямые ссылки на использование протеасомальных ингибиторов. В таблице 1 перечислены публикации по основным протеасомальным ингибиторам. MG132 является наиболее предпочтительным ингибитором для лабораторных исследований.

Основные характеристики трех протеасомальных ингибиторов перечислены в таблице 2.

ингибитормеханизмиспользованиехранениеДополнительная информация
MG132обратимый~10 микромоль, 1 час-20CДёшев, <150 USD/5 мг, также ингибирует активацию NF-kB (IC50 = 3 микромоль) и кальпаин
лакткцистиннеобратимый~10 микромоль, 2 часа-20CДорог, также ингибирует активацию NF-kB, более специфичен в отношении протеасомальной активности, чем MG132
Протеасомальный ингибитор I
Таблица 2. Основные характеристики протеасомальных ингибиторов, концентрации для применения, хранение в лабораторных исследованиях.
MG132

MG132, также называемый карбобензокси-L-лейцил-L-лейцил-L-leucinal или Z-LLL-CHO, представляет собой пептидный альдегид, относящийся к группе веществ, способных ингибировать различные типы протеаз, включая сериновые протеазы, в том числе, калпаин и др. Было показано, что MG132 и другие пептидные альдегиды являются сильными ингибиторами активности протеасомальной пептидазы, а также активности калпаина [2].

Некоторые из методов применения MG132 в публикациях, проанализированных Labome, и ссылки приведены в таблице 3. Публикации указывают концентрации 1, 10, 25 и 50 микромоль для использования в течение периода от 1 до нескольких дней.

Тип клетокиспользованиеСсылки
Клетки 293T и EFM192A10 микромоль, 1 час [3]
Клетки A. Polyphaga и HEK2930.1 микромоль за 1 час до инфицирования и эта концентрация поддерживалась в течение эксперимента [1]
Клетки A43110 микромоль [4]
Клетки COS-7 и HeLa20 микромоль, 24 часа [5]
Клетки COS-725 микромоль, 5 часов [6]
Клетки H1299, U2OS и HeLa10 микромоль, 12 часов [7]
Клетки HeLa20 миллимоль (?), 24 часа [8]
Клетки HEK29325 микромоль, 4 часа [9]
Клетки HEK2931 микромоль, 16 часов [10]
Клетки HEK-293T50 микромоль, от 4 до 7 часов [11]
Таблица 3. Ссылки на использование MG132 (время использования и концентрации).

Протеасома является неотъемлемой частью клеточных функций. MG132, как и другие ингибиторы протеосом, является токсичным для клеток и тканей и вызывает гибель клеток при высоких концентрациях или после длительного воздйствия. Для достижения оптимальной концентрации рекомендуется титровать ингибиторы протеасом при значительном диапазоне (например, 1000 x). Оптимальная концентрация зависит не только от конкретного типа клетки, но также от таких параметров клеточной культуры как плотность клеточного слоя, концентрации сыворотки и состава культуральной среды.

MG132 должен храниться при -20°С, и может быть растворён в ДМСО (10 мг/мл) и метаноле (1 мг/мл) и храниться при -20°С или -80°С. Если MG132, растворённый в ДМСО, дает осадок при добавлении в культуральную среду, раствор ДМСО может быть нагрет до 40°С.

В публикациях, проанализированных Labome, упомянуто несколько производителей MG132, включая EMD Millipore (номер по каталогу 474790)с Calbiochem, EMD Biosciences. Merck является одним из основных поставщиков MG132 в упомянутых публикациях.

MG132 от EMD Millipore / Merck / Calbiochem был использован для изучения роли митоген-активированной протеинкиназы и NFκB в моноцитах человека [12], взаимодействий между кадгерин-зависимой адгезией и сигнальным путём Wnt [4], механизма действия A20 в ингибировании сигнального пути NFκВ [13], ассоциации водного канала AQP1 с бета-амилоидными отложениями в мозге при болезни Альцгеймера [14], BMP сигнала при раке толстой кишки [15], механизма деградации IkappaBalpha [16], регулирования стабильности DNMT1 в клетках млекопитающих [5], роли RanBP2 и SENP3 в регуляции сумоиляции бореалина [17] и аутоубиквитинизации cIAP1, индуцированной антагонистами [3].

MG-132 от Boston Biochem (в настоящее время R & D System) был использован в качестве протеасомального ингибитора в культивируемых клетках для изучения регуляции экспрессии COMMD1 [18].

MG-132 от BIOMOL (ныне Enzo Life Sciences, номер в каталоге - BML-PI102-0005) использовался для изучения роли убиквитинлигазы, регулируемой железом, в гомеостазе железа [9].

Протеасомальный ингибитор MG132 от Sigma использовался в ряде исследований [7, 8, 10, 19-23]. Biovision [1], Peptide Institute [6] и VWR International [11] также были упомянуты в публикациях.

Протеасома ингибиторы Рисунок 2
Рисунок 2. Химическая структура MG132.
Лактацистин

Лактацистин представляет собой антибиотик, изначально выделенный из Streptomyces и теперь синтезируемый химическим путем. Он гидролизуется в клетках и в естественных условиях в живых организмах в класто-лактацистин бета-лактон, который, вероятно, является активным ингибитором, ковалентно модифицирующим N-концевой треонин субъединицы X в протеасоме млекопитающих 20S. Ковалентное связывание высоко специфично и, следовательно, не влияет на цистеин или серин протеазы, являясь более специфичным, чем пептидные альдегиды, такие как MG132.

Протеасома ингибиторы Рисунок 3
Рисунок 3. Химическая структура лактацистина.

Лактацистин использовался в концентрациях 10 микромоль и 25 микромоль в течение часов в культуре клеток.

Тип клетокИспользованиеСсылки
BxPC-310 микромоль, 12, 24, 48 часов [24]
Клетки HEK-293T25 микромоль, от 4 до 7 часов [11]
Клетки RAW 264.710 микромоль, 2 часа [25]
Таблица 4. Ссылки на использование лактацина (время использования и концентрация)
Другие протеасомальные ингибиторы
Протеасомальный ингибитор I

Протеасомальный ингибитор I (PSI) от Calbiochem был использован для инкубации трансфектированных клеток [26], и протеасомальный ингибитор I от Peptide Institute PSI (N-карбобензокси-L-изолейцин-L-гамма-т-бутил-L-глутамил-L-аланил-L-лейцинал) был использован для экспериментов на культуре клеток [27].

PS-341, MG-341, Velcade

Velcade (синонимы: PS-341, MG-341) был использован в лабораторном эксперименте для ингибирования протеасомальной активности [1]. Клеточная токсичность Velcade была исследована. Использование Velcade в концентрации 50 мкмоль/л не вызвала значительной потери HEK-293 клеток в течение 8 часов. Длительное инкубация (24 часа) с Velcade в концентрации от 0,5 до 50 мкмоль/л вызвала гибель около 40% клеток [19].

XAV 939

ADP-рибозилирование PI31 АДФ-рибозилтрансферазной танкиразы (ТНКЗ) предотвращает 20S-индуцированное ингибирование PI31 и тем самым способствует активности 26S протеасомы[]. XAV939, имеющий малый размер молекулы и ингибирующий TNKS и XAV939, может блокировать СADP-рибозилирование PI31.

Проверка протеасомального ингибирования.

Одной из важных проблем, связанных с использованием протеасомального ингибирования, является обеспечение того, что протеасомальная активность действительно ослабляется. Существует несколько подходов, которые могут быть использованы для проверки эффективности ингибирования. Один простой способ состоит в использовании Suc-LLVY-AMC (N-сукцинил-L-лейцил-L-лейцил-L-лейцил-7-амидо-4-метилкумарин) в качестве флуоресцентного индикатора активности протеасомы [28]. Другой способ состоит в изучении соотношения между уровнями фрагментов моно- и полиубиквитина посредством вестерн-блоттинга. Более низкий уровень моноубиквитина должен обнаруживаться в случае ингибирования активности протеасомы.

Ссылки
  1. Price C, Al-Quadan T, Santic M, Rosenshine I, Abu Kwaik Y. Host proteasomal degradation generates amino acids essential for intracellular bacterial growth. Science. 2011;334:1553-7 pubmed publisher
  2. Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S. Differential inhibition of calpain and proteasome activities by peptidyl aldehydes of di-leucine and tri-leucine. J Biochem. 1996;119:572-6 pubmed
  3. Dueber E, Schoeffler A, Lingel A, Elliott J, Fedorova A, Giannetti A, et al. Antagonists induce a conformational change in cIAP1 that promotes autoubiquitination. Science. 2011;334:376-80 pubmed publisher
  4. Kam Y, Quaranta V. Cadherin-bound beta-catenin feeds into the Wnt pathway upon adherens junctions dissociation: evidence for an intersection between beta-catenin pools. PLoS ONE. 2009;4:e4580 pubmed publisher
  5. Esteve P, Chin H, Benner J, Feehery G, Samaranayake M, Horwitz G, et al. Regulation of DNMT1 stability through SET7-mediated lysine methylation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:5076-81 pubmed publisher
  6. Feng S, Muraoka-Cook R, Hunter D, Sandahl M, Caskey L, Miyazawa K, et al. The E3 ubiquitin ligase WWP1 selectively targets HER4 and its proteolytically derived signaling isoforms for degradation. Mol Cell Biol. 2009;29:892-906 pubmed publisher
  7. Xu L, Chen Y, Song Q, Xu D, Wang Y, Ma D. PDCD5 interacts with Tip60 and functions as a cooperator in acetyltransferase activity and DNA damage-induced apoptosis. Neoplasia. 2009;11:345-54 pubmed
  8. Yamagishi Y, Honda T, Tanno Y, Watanabe Y. Two histone marks establish the inner centromere and chromosome bi-orientation. Science. 2010;330:239-43 pubmed publisher
  9. Vashisht A, Zumbrennen K, Huang X, Powers D, Durazo A, Sun D, et al. Control of iron homeostasis by an iron-regulated ubiquitin ligase. Science. 2009;326:718-21 pubmed publisher
  10. Picard N, Charbonneau C, Sanchez M, Licznar A, Busson M, Lazennec G, et al. Phosphorylation of activation function-1 regulates proteasome-dependent nuclear mobility and E6-associated protein ubiquitin ligase recruitment to the estrogen receptor beta. Mol Endocrinol. 2008;22:317-30 pubmed
  11. Noels H, Somers R, Liu H, Ye H, Du M, De Wolf-Peeters C, et al. Auto-ubiquitination-induced degradation of MALT1-API2 prevents BCL10 destabilization in t(11;18)(q21;q21)-positive MALT lymphoma. PLoS ONE. 2009;4:e4822 pubmed publisher
  12. Wu W, Alexis N, Chen X, Bromberg P, Peden D. Involvement of mitogen-activated protein kinases and NFkappaB in LPS-induced CD40 expression on human monocytic cells. Toxicol Appl Pharmacol. 2008;228:135-43 pubmed publisher
  13. Shembade N, Ma A, Harhaj E. Inhibition of NF-kappaB signaling by A20 through disruption of ubiquitin enzyme complexes. Science. 2010;327:1135-9 pubmed publisher
  14. Misawa T, Arima K, Mizusawa H, Satoh J. Close association of water channel AQP1 with amyloid-beta deposition in Alzheimer disease brains. Acta Neuropathol. 2008;116:247-60 pubmed publisher
  15. Wu W, Sung J, Wu Y, Li Z, Yu L, Cho C. Bone morphogenetic protein signalling is required for the anti-mitogenic effect of the proteasome inhibitor MG-132 on colon cancer cells. Br J Pharmacol. 2008;154:632-8 pubmed publisher
  16. Mathes E, O'Dea E, Hoffmann A, Ghosh G. NF-kappaB dictates the degradation pathway of IkappaBalpha. EMBO J. 2008;27:1357-67 pubmed publisher
  17. Klein U, Haindl M, Nigg E, Muller S. RanBP2 and SENP3 function in a mitotic SUMO2/3 conjugation-deconjugation cycle on Borealin. Mol Biol Cell. 2009;20:410-8 pubmed publisher
  18. Maine G, Mao X, Muller P, Komarck C, Klomp L, Burstein E. COMMD1 expression is controlled by critical residues that determine XIAP binding. Biochem J. 2009;417:601-9 pubmed publisher
  19. Gastaldello S, D'Angelo S, Franzoso S, Fanin M, Angelini C, Betto R, et al. Inhibition of proteasome activity promotes the correct localization of disease-causing alpha-sarcoglycan mutants in HEK-293 cells constitutively expressing beta-, gamma-, and delta-sarcoglycan. Am J Pathol. 2008;173:170-81 pubmed publisher
  20. Sha Y, Pandit L, Zeng S, Eissa N. A critical role for CHIP in the aggresome pathway. Mol Cell Biol. 2009;29:116-28 pubmed publisher
  21. Yu C, Friday B, Yang L, Atadja P, Wigle D, Sarkaria J, et al. Mitochondrial Bax translocation partially mediates synergistic cytotoxicity between histone deacetylase inhibitors and proteasome inhibitors in glioma cells. Neuro Oncol. 2008;10:309-19 pubmed publisher
  22. Stang S, Lopez-Campistrous A, Song X, Dower N, Blumberg P, Wender P, et al. A proapoptotic signaling pathway involving RasGRP, Erk, and Bim in B cells. Exp Hematol. 2009;37:122-134 pubmed publisher
  23. Rowe R, Li X, Hu Y, Saunders T, Virtanen I, Garcia de Herreros A, et al. Mesenchymal cells reactivate Snail1 expression to drive three-dimensional invasion programs. J Cell Biol. 2009;184:399-408 pubmed publisher
  24. Ni X, Zhou L, Wang G, Liu S, Bai X, Liu F, et al. The ubiquitin-proteasome pathway mediates gelsolin protein downregulation in pancreatic cancer. Mol Med. 2008;14:582-9 pubmed publisher
  25. Larabee J, DeGiusti K, Regens J, Ballard J. Bacillus anthracis edema toxin activates nuclear glycogen synthase kinase 3beta. Infect Immun. 2008;76:4895-904 pubmed publisher
  26. Vafiadaki E, Arvanitis D, Pagakis S, Papalouka V, Sanoudou D, Kontrogianni-Konstantopoulos A, et al. The anti-apoptotic protein HAX-1 interacts with SERCA2 and regulates its protein levels to promote cell survival. Mol Biol Cell. 2009;20:306-18 pubmed publisher
  27. Choi M, Najafi F, Safa A, Drexler H. Analysis of changes in the proteome of HL-60 promyeloid leukemia cells induced by the proteasome inhibitor PSI. Biochem Pharmacol. 2008;75:2276-88 pubmed publisher
  28. Arlt A, Minkenberg J, Kruse M, Grohmann F, Folsch U, Schäfer H. Immediate early gene-X1 interferes with 26 S proteasome activity by attenuating expression of the 19 S proteasomal components S5a/Rpn10 and S1/Rpn2. Biochem J. 2007;402:367-75 pubmed
ISSN : 2329-5139