Маркеры нейрональных клеток
Patima Tanapat (patima dot tanapat at gmail dot com)
Princeton, New Jersey, United States
Перевод
Aleksei Stepanenko (a dot a dot stepanenko at gmail dot com)
Laboratory of Biosynthesis of Nucleic Acids, Department of Functional Genomics, 150 Zabolotnogo Street, Kyiv 03680, Ukraine
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.3.196
Дата
последнего обновления : 2016-08-22; оригинальная версия : 2013-06-05
Цитировать как
MATER METHODS ru 2013;3:196
Абстракт

Подробный обзор иммуногистохимических маркеров для нейрональных типов клеток ЦНС

English Abstract

A comprehensive review of immunohistochemical markers for CNS neuronal cell types

Введение

Нейроны являются основными компонентами передачи сигналов в мозге. Следовательно, фундаментом любой попытки понять, как работает мозг в целом, является исследование функционально различных нейрональных типов клеток. С этой целью появились иммуногистохимические маркеры в качестве одного из наиболее ценных инструментов, доступных для исследователей. Используя антитела к различным компонентам клетки, исследователи способны идентифицировать клетки с нейрональным фенотипом и, кроме того, получать информацию относительно их морфологических характеристик и экспрессии специфических белков.

В следующих разделах будут обсуждаться способы, с помощью которых могут быть идентифицированы различные нейрональные типы клеток. Кроме того, так как возможность различать между нейронами и другими типами клеток головного мозга имеет важное значение, также будет приведено краткое описание других типов клеток. И, наконец, будет обсуждаться использование иммуногистохимии в качестве инструмента для изучения популяций нейронов с акцентом на наиболее часто используемых маркерах и некоторых ключевых факторов при выборе маркера для конкретного исследования.

Клетки головного мозга
Нейроны

Нейроны состоят из четырех различных морфологических областей: тела клетки (сомы), дендритов, аксона и пресинаптических окончаний. Узкоспециализированная структура этих клеток позволяет им распространять электрические сигналы, или потенциалы действия, которые служат основой для взаимодействия между нейронами. Сома является метаболическим центром клетки. Здесь находится ядро, содержащее ДНК клетки, а также другие органеллы. Сома интегрирует два типа процессов. Первый тип, осуществляемый дендритами, - это прием поступающей информации, тогда как второй тип, осуществляемый аксоном, - передача исходящей информации. Как правило, нейрон имеет несколько дендритов. Каждый из этих дендритов может в свою очередь содержать от сотен до тысяч шипов, которые являются местами контакта с аксонами других нейронов. (Следует отметить, что аксоны могут также образовывать синапсы на соме или аксоне, хотя это менее часто). Аксон возникает из специализированной области тела клетки, называемой бугор аксона, и отвечает за распространение потенциала действия. В конце концов, аксон делится на несколько ветвей, которые заканчиваются в синапсах. Хотя синапсом называется точка контакта между нейронами, клетки физически не контактируют друг с другом, а разделены пространством, которое называется синаптической щелью. В конце каждой ветви аксонов находится пресинаптическое окончание, которое содержит пузырьки, заполненные нейромедиатором. Когда потенциал действия достигает пресинаптических окончаний, везикулярное содержимое высвобождается в синаптическую щель, осуществляя химическое взаимодействие с постсинаптической клеткой.

Глия

Кроме нейронов мозг также состоит из другого класса клеток, называемых глиальными. Глиальные клетки обеспечивают структурную и метаболическую поддержку нейронов. Они могут быть широко классифицированы на макроглию и микроглию. Существуют четыре основных класса макроглии: астроциты, олигодендроциты, эпендимные клетки и радиальная глия. Астроглиальные клетки поддерживают и питают клетки головного мозга. Они контролируют внеклеточный ионный баланс и оказывают биохимическую поддержку эндотелиальным клеткам, поддерживая гематоэнцефалический барьер. Олигодендроциты ответствены за продукцию и поддержание миелина, который изолирует аксоны и способствует распространению потенциалов действия. Эпендимные клетки образуют эпителиальные выстилки желудочков, полостей мозга, содержащих спинномозговую жидкость, и центральный канал спинного мозга. Они также формируют эпителиальный слой, окружающий сосудистое сплетение, который производит спинномозговую жидкость, действуя в качестве связующего звена между кровью и центральной нервной системой. Радиальная глия, которая характеризуется длинными радиальными отростками, оказывает помощь в миграции новых нейронов, играет определенную роль в формировании паттерна и область-специфической дифференцировке ЦНС и была определена в качестве предшественника, дающего начало нейронам и глии [1, 2].

Микроглия первоначально происходит из миелоидных клеток-предшественников в костном мозге и играет решающую роль в клеточном иммунитете центральной нервной системы, в том числе презентации поверхностных антигенов, а также способствует воспалению через секрецию различных цитокинов [3]. Микроглия обладает способностью удалять твердые частицы путем фагоцитоза и секретировать факторы, которые могут влиять на прогрессирование заболевания [4]. Во время развития микроглия, как полагают, играет определенную роль в ремоделировании синапсов, апоптозе, клиренсе фагоцитов и ангиогенезе [5]. Во взрослом организме микроглия участвует в регуляции клеточной гибели, устранении синапсов, нейрогенезе и ремоделировании сосудистой сети ЦНС в условиях патологического инсульта [5, 6]. Эти наблюдения указывают на то, что микроглия имеет важное значение для созревания и пластичности нервных цепей, а также поведения, регулируемого этими цепями. В соответствии с этой идеей было высказано предположение, что дисфункция микроглии может быть фактором, способствующим развитию психических и неврологических расстройств [4].

Микрососудистые ткани мозга

Также отношение к нашему обсуждению не нейрональных клеток имеют эндотелиальные клетки, которые составляют микрососуды мозга. Наряду с астроцитами эти клетки образуют гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). ГЭБ регулирует движение ионов, молекул и клеток между кровью и центральной нервной системой, обеспечивая необходимую среду для правильной нейронной функции, а также защиту от травм и болезней. Главная роль ГЭБ - это предотвращение попадания в мозг токсических веществ из крови.

Идентификация типов нейрональных клеток

Отец-основатель нейробиологии Сантьяго Рамон-и-Кахаль был первым человеком, который указал на огромное разнообразие, существующее среди популяции нейронов. Используя метод серебряного окрашивания, предложенный Камилло Гольджи, он наблюдал весьма различные морфологические особенности отдельных нейронов. При этом он обнаружил, что клетки, составляющие мозг, сильно варьировали по размеру и форме. В то время как некоторые нейроны, такие как зернистые клетки, демонстрировали относительно простые отростки, возникающие из небольшого тела клетки, другие, как клетки Пуркинье мозжечка, характеризовались очень витиеватыми и сложными выростами.

С момента открытия Кахала ученые смогли выделить сотни различных нейрональных типов клеток. Тем не менее, не существует единой системы классификации. Это, в частности, связано с тем, что имена, присвоенные различным клетки, имеют тенденцию изменяться по мере роста описательной точности. Кроме того, категории нейронов часто перекрывают друг друга, в результате чего конкретный тип клеток может быть связан с несколькими различными именами. В целом, однако, нейроны могут быть классифицированы в соответствии с критериями, которые включают морфологию, паттерн отростков, электрофизиологические свойства и биохимические характеристики.

Примеры классификаций на основе морфологии (например, размер, форма сомы и дендритные узоры ветвления), возможно, являются наиболее распространенными в научной литературе. Форма нейрона может указывать на его функциональное значение, и, наоборот, функции диктуют форму. Возьмем, например, форму восходящих волокон и ветвей аксонов гранулярных клеток в мозжечке. Здесь форма аксона определена специфическими соединениями с дендритами клеток Пуркинье-мишеней, при которых ветвистая структура аксона создает многочисленные контакты с одним дендритом [7]. Иной пример - пирамидальные клетки. Термин пирамидальная клетка в широком смысле относится к клеткам, которые характеризуются большой треугольной сомой с различным количеством апикальных и базальных дендритов. Эта структурная организация наводит на мысль о роли, которую эти клетки играют в интеграции различных сигналов, полученных от различных клеточных слоев, в единое сообщение, которое передается в другую область мозга [8].

Другим структурным отличием являются проекции аксонов нейронов. Клетки, аксоны которых выходят за пределы дискретной популяции нейронов, к которым они принадлежат (т.е. ядро), называются проекционными, или главными нейронами, в то время как те, которые создают синаптические контакты только в пределах своего ядра, называются интернейронами, или внутренними нейронами. Следует подчеркнуть, что эти термины относятся только к проекциям аксонов, а не к источнику исходных данных. Таким образом, проекционные нейроны могут получать только локальные входные сигналы и, наоборот, внутренние нейроны могут принимать входные сигналы от другого ядра. Определение этих форм соединений имеет важное значение, поскольку это дает представление о потоке обработки информации, лежащей в основе функции, связанных с этими клеточными популяциями. На самом деле эта ключевая концепция лежит в основе значительных усилий, которые в последнее время были направлены на составление комплексных карт нейронных связей в мозге, называемые "Коннектомы" [9] Нейрональные типы клеток также могут быть различимы по своим электрофизиологическим свойствам. Например, неокортикальные нейроны, которые демонстрируют существенные различия в своих потенциалах действия ответных паттернов, как правило, классифицируются на regular-spiking (RS), fast-spiking (FS) и intrinsically bursting (IB) клетки. RS клетки значительно адаптируются в ответ на раздражители, тогда как FS клетки поддерживать высокую частоту возбуждения практически без адаптации, и IB клетки генерируют кластеры пиков однократно или повторно [10, 11]. Разнообразие intrinsically bursting паттернов этих клеток имеет важное значение, поскольку представляет собой дополнительный уровень, на котором реакция этих клеток к стимулам может быть модулирована.

Иммуногистохимия может быть использована для получения информации о морфологии и, в некоторой степени, проекции аксонов различных популяций нейронов. Тем не менее, реальная польза методологии заключается в возможности отличить клетки на основании их биохимических характеристик. Действительно, как будет описано в следующих разделах, идентификация нейронов по их ассоциации с конкретной нейромедиаторной системой или экспрессией специфического гена или белка является часто используемой стратегией.

Иммуногистохимия как инструмент для выявления нейрональных типов клеток

В то время как окрашивание по Гольджи остается полезным инструментом для идентификации нейрональных типов клеток, данный метод сопряжен с определенными недостатками. Вероятно, наиболее значительным из них является то, что даже в случае успеха окрашивание имеет тенденцию быть переменным. Несмотря на шанс полной оксраски дендритного дерева, мелкие разветвления аксонов и их дистальные концевые терминали трудно маркировать [12]. Кроме того, по причинам, которые неизвестны, окрашивание происходит только в 1-10% клеток [13, 14]. Данный подход не подходит для определения специфических клеток, а также увеличивает количество ткани, которую необходимо обработать для достижения соответствующих размеров выборки.

С появлением в 1970-х иммуногистохимических стратегий для выявления типов клеток исследователи смогли обойти некоторые технические вопросы, связанные с более старыми методами, такими как окрашивание по Гольджи. К тому времени исследователи начали использовать иммуногистохимию для выявления нейронов, содержащих моноамин-синтезирующие ферменты тирозингидроксилазу (TH), дофамин-бета-гидроксилазу (DBH)и триптофангидроксилазу (TrH) [15, 16, 16]. Тем не менее, именно после докладов, описывающих использование нейрон-специфической энолазы (NSE) и не нейрональной энолазы (NNE) в качестве специфических маркеров нейрональных и глиальных клеток, соответственно; началось массовое использование иммуногистохимии для детекции нейрональных клеток [17]. Последовали другие исследования, предлагающие в качестве маркеров для иммунноокрашивания целый ряд различных антигенов, дифференцированно экспрессирующихся среди нейрональных типов клеток: NGF-индуцируемый большой наружный гликопротеин (NILE-GF) [18], холин ацетилтрансферазу [19], парвальбумин [20] и белок нейрофиламентов [21, 22]. Не все из этих белков по-прежнему широко используются сегодня.

Чаще всего молекулярная природа и функциональные свойства используемых нейрональных антигенов не были известны в момент их открытия. Тем не менее, их достоверная экспрессия в конкретных популяциях нейронов была признана. Кроме того, были значительными преимущества использования иммуногистохимии. Методика была технически доступной, и комбинированная иммуногистохимия могла быть использована для колокализации нейрональных маркеров с различными другими функциональными маркерами.

Совсем недавно были разработаны молекулярные подходы, которые помогают выяснить нейрональные характеристики. Стали доступны для исследователей методы, которые используют транскрипционные модуляторы и сайт-специфические рекомбиназы для мечения конкретных популяций нейронов [23]. Тем не менее, иммуногистохимии удалось сохранить свой статус в качестве методологии для идентификации нейрональных типов клеток, поскольку она является относительно низкой по стоимости выполнения, не требует множества специализированного оборудования, а также использует реагенты, которые широкодоступны. Кроме того, обычные микроскопические методы могут быть использованы для сбора данных, и в зависимости от метода визуализации иммунопомеченные ткани могут долго сохраняться.

В настоящее время исследователи имеют широкий спектр иммуногистохимических маркеров в своем распоряжении, чтобы отличить фенотипы клеток в головном мозге. В следующем разделе будут обсуждаться некоторые из маркеров, наиболее часто используемые для идентификации нейронов и глии

Маркеры нейрональных клеток Рисунок 1
Рисунок 1. C6 нейроны взрослых крыс, покрашенные антителами к NSE (зеленый) и красителем DAPI (синий). Шкала = 20 мкм. Взято из [76].
.
Маркеры нейронов
Нейрон-специфическая энолаза (NSE)

NSE, также называемая гамма-энолаза или энолаза 2, представляет собой цитозольный белок, экспрессируемый зрелыми нейронами и клетками нейронального происхождения (Рисунок 1). Это специфичный для головного мозга гликолитический фермент, который играет важную роль во внутриклеточном энергетическом метаболизме [24]. В процессе развития уровень NSE очень низкий, но затем увеличивается в течение периода времени, связанного с морфологическим и функциональным созреванием нейронов [25].

В то время как NSE широко используется и принята в качестве нейронального маркера, важно отметить, что, как было показано, при определенных условиях она экспрессируется в глиальных клетках. В частности, обнаруженные уровни NSE активности, экспрессии мРНК и белка в культивируемых олигодендроцитах были подобны тем, которые наблюдаются в культуре нейронов [26]. Ее экспрессия увеличивается во время дифференцировки олигодендроцитов, но подавляется, как только клетки становятся зрелыми. При патологических условиях NSE также детектируется в глиальных опухолях и реактивных глиальных клетках [27].

Нейрональный ядерный антиген (NeuN)

В 1992 году Mullen et al. сообщили о получении моноклональных антител, которые узнают нейрон-специфический ядерный белок у позвоночных (Рисунок 2) [28]. Этот белок, который они назвали Нейрональный ядерный антиген (NeuN), был обнаружен в большинстве нейрональных типов клеток по всей центральной и периферической нервной системе взрослых мышей. Появление NeuN соответствует по времени с выходом нервных клеток из клеточного цикла и/или с началом терминальной дифференцировки. Белок можно обнаружить в эмбриональных и взрослых нейронах, за исключением клеток Пуркинье мозжечка, обонятельных митральных клеток луковицы, фоторецепторных клеток сетчатки и дофаминергических нейронов в черной субстанции [29, 30].

Маркеры нейрональных клеток Рисунок 2
Рисунок 2. Пример NeuN окрашивания нейронов в коре головного мозга мыши. Взято из [77].

Несмотря на широкое иммуногистохимическое определение NeuN, до недавнего времени функция NeuN была неизвестна. Исследователи идентифицировали NeuN как Fox-3 белок, участвующий в регуляции сплайсинга мРНК [31]. Поскольку Fox-3 экспрессируется исключительно в нейронах, было высказано предположение, что он играет определенную роль в регуляции нейронной клеточной дифференцировке и развитии нервной системы [31].

Ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP-2)

MAP-2 представляет собой нейрон-специфический цитоскелетный белок, который используется в качестве маркера нейронального фенотипа [32]. Он экспрессируется в нервной системе позвоночных как в эмбриональных, так и взрослых тканях. В нейрональных предшественниках экспрессия слабая, но становится выраженной позже (примерно через один день после экспрессии нейрон-специфической изоформы тубулина βIII) [33]. Исследования на крысах показали существование, по крайней мере, трех изоформ MAP-2, включая 2а, 2b и 2с. MAP-2с, как считается, экспрессируется исключительно на ранних стадиях развития и только в аксонах. Затем в течение созревания MAP-2с заменяется MAP2a. В отличие от этого MAP2b экспрессируется на протяжении всей жизни.

MAP-2 белок, как полагают, участвует в сборке микротрубочек, стабилизируя их рост путем сшивания с промежуточными филаментами и другими микротрубочками. В частности, он может играть определенную роль в детерминации и стабилизации дендритной формы в процессе развития нейронов и, соответственно, детектируется только в пределах дендритного дерева [34]. В общем, его экспрессия, как представляется, ограничивается нейронами и реактивными астроцитами [35].

ßIII Тубулин (TuJ1)

TuJ1 представляет собой тубулин, экспрессирующийся во время дифференцировки нейрональных типов клеток [36]. Тубулины являются основными строительными блоками микротрубочек, которые, в свою очередь, являются структурными компонентами цитоскелета, играющего роль в поддержании структуры клеток, митозе, мейозе, внутриклеточном транспорте и др. Иммуногистохимическое окрашивание TuJ1 обнаруживается в соме, дендритах, аксонах и окончаниях аксонов незрелых нейронов. Одним из существенных преимуществ, связанных с использованием иммуногистохимического детектироания TuJ1, является степень, с которой он раскрывает мелкие детали аксонов и окончаний (Рисунок 3). TuJ1 полезен в обнаружении связанных с травмами изменений в составе цитоскелета [37]. Хотя одна из форм бета-тубулина также встречается в глиальных клетках, она не распознается антителами к TuJ1 [37].

Маркеры нейрональных клеток Рисунок 3
Рисунок 3. Даблкортин-окрашенные клетки в зубчатой извилине взрослых мышей. Взято из [78].
Даблкортин (DCX)

DCX широко экспрессируется мигрирующими нейронами и наблюдается на самых ранних этапах развития нейронов [38]. Это ассоциированный с микротрубочками белок, который экспрессируется в постмитотических нейронах и участвует в ростовых нейрональных процессах на переднем крае клетки [39]. В соответствии с этой ролью наиболее интенсивное DCX иммунноокрашивание наблюдается в окончаниях нейритов и в проксимальных областях конусов роста .

c-fos

Активацию c-fos использовали как маркер нейрональной активности [40, 41].

Клинически значимые маркеры нейронов

Следует отметить, что существуют маркеры нейронального фенотипа клеток, которые представляют особый интерес из-за их полезности в понимании патологии клинической картины заболевания. Два из таких маркера - это холинацетилтрансфераза и тирозингидроксилаза.

Холинацетилтрансфераза (ChAT)

ChAT является ферментом, ответственным за синтез ацетилхолина. Поскольку она экспрессируется в подавляющем большинстве холинергических нейронов, ChAT иммунореактивность часто используется в качестве биомаркера когнитивных нарушений при различных нейродегенеративных расстройствах. Ее обнаружение было важным инструментом для исследования неврологических изменений, характерных для болезни Альцгеймера, связанной с существенной потерей базальных холинергических нейронов переднего мозга. Посмертные исследования с испьзованием ChAT иммуногистохимии выявили снижение в плотности волокон и аксонов ChAT -позитивных нейронов в верхней лобной коре и миндалинах больных с когнитивными нарушениями [42, 43]. Кроме того, на животных моделях иммуногистохимию использовали для оценки способности экспериментальных манипуляций изменять количество ChAT-позитивных нейронов в медиальной перегородке и области Брока [44, 45]. Иммуномечение применялось для оценки холинергических нейронов в поясной извилине, двигательной и сенсорной коре и базальных отделах переднего мозга [46, 47].

Тирозингидроксилаза (TH)

Иммуногистохимическая детекция фермента TH является важным инструментом для исследования болезни Паркинсона, состояния, характеризующегося расстройством движения, связанного с потерей допаминергических клеток черной субстанции. TH является скорость лимитирующим ферментом в синтезе дофамина (а также адреналина и норадреналина). В постсмерных исследованиях аутопсий TH-иммуногистохимия используется для количественной оценки степени потери дофаминергическая клеток у пациентов с болезнью Паркинсона [48]. Для того, чтобы определить, может ли этот тип потери быть смягчен терапевтическим вмешательством, TH иммуногистохимия используется как средство для изучения защитных эффектов различных экспериментальных манипуляций в животных моделях болезни Паркинсона [49, 50].

Дополнительные маркеры нейронов

В дополнение к маркерам, которые были описаны выше, существует значительное число других нейрон-ассоциированных маркеров, которые коммерчески доступны для анализа (Таблица 1).

МаркерЛокализацияФункцияАссоциированные нейроны
Полисиаловая кислота-нейрональная молекула клеточной адгезии (PSA-NCAM )Плазматическая мембрананейрональная молекула клеточной адгезии играет роль в регуляции клеточной формы, роста, миграции во время развития; вовлечена в регулирование активность-индуцированной пластичности у взрослых [51] эспрессируется в популяции незрелых нейронов
Нейрогенная дифференциация 1 (NeuroD or Beta2)цитоплазматическая и ядернаятранскрипционный фактор, участвует в дифференцировке нервной системы; требуется для правильной дифференцировки постнатальных микронейронов, отсутствие приводит к гибели клеток [52] экспрессируется в популяции незрелых нейронов
Tauдистальные части аксонов, не присутствует в дентритах*хорошо растворимый, ассоциированный с микротрубочками белок, встречается в основном в нейронах при сравнении с не нейрональными клетки [53] ; модулирует стабильность цитоскелета и обеспечивает гибкость аксонов [54] на высоком уровне экспрессируется в нейронах; а также на низких уровнях в астроцитах и олигодендроцитах
Кальбиндин-D28kТело клетки, дентриты и шипыКальций-связывающий белок; играет определенную роль в быстрой буферизации кальция [55] нейроны Пуркинье; экспрессируется в нейроэндокринных клетках
Кальретининцитозоль29kDa белок с 58% гомологией с кальбиндином-D28; первый кальций-связывающий белок, экспрессируемый в ЦНС позвоночных [56] широко распространен в различных популяциях нейронов, включая корковые интернейроны
Нейрофиламент (NFP)аксонынейрональный белок цитоскелета; промежуточный филамент; обеспечивает структурную поддержку аксонов и регулирует их диаметр [24, 57] экспрессируется в различных нейрональных популяциях; в некоторых нейронах уровень экспрессии относительно низкий
Таблица 1. Дополнительные часто используемые гистохимические маркеры нейронов ЦНС.
Маркеры глии
Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)

Без сомнения одним из наиболее широко используемых маркеров астроглиальных клеток является GFAP (Рисунок 4). GFAP является промежуточным филаментом, который формирует сеть, обеспечивающую поддержку и прочность клеткам. Он контролирует их форму, движение и функции. В условиях заболевания (травмы или болезни) астроглиальные клетки быстро увеличивают продукцию GFAP [58]. Совсем недавно были идентифицированы ряд GFAP изоформ [59], в том числе GFAPδ, которая экспрессируется в пролиферативной радиальной глии в процессе развития, а также в нервных стволовых клетках взрослых [60].

Маркеры нейрональных клеток Рисунок 4
Рисунок 4. A GFAP-окрашенные клетки гиппокампа крысы. Шкала = 15 мкм. Взято из [79].
S100β

S100β представляет собой белок, экспрессируемый подтипом зрелых астроцитов, которые окаймляют кровеносные сосуды и NG2-экспрессирующие клетки, которые, как полагают, являются предшественниками для олигодендроцитов и субпопуляций астроцитов [61, 62]. S100β имеет множество различных функций, в том числе участвует в росте нейритов, астроцитозе, аксональной пролиферации и ингибировании сборки микротрубочек [63, 64]. Кроме того, S100β выступает в качестве нейротрофического фактора в процессе развития, и его экспрессия повышается при повреждениях во взрослом организме [63].

Виментин

Промежуточная филамент виментин является компонентом цитоскелета астроглиальных клеток. Он также экспрессируется радиальной глией и играет важную роль в процессе развития. Более конкретно, участвует в организации критических белков, участвующих в адгезии, миграции и клеточном сигналинге [65]. В условиях травмы виментин участвует в активации микроглии [66] и ассоциирован с миграцией реактивных астроцитов к участкам фокальных травм [67]. В общем, виментин надежно используется в качестве глиального маркера. Тем не менее, следует отметить, что он также экспрессируется в нейронах во время развития и в условиях повреждения [68].

2', 3'-циклический нуклеотид 3'-фосфодиэстераза (CNPase)

CNPase представляет собой фермент, экспрессирующий на высоком уровне в центральной и периферической нервной системе. Она детектируется почти исключительно в олигодендроцитах (и шванновских клетках) [69] и, как полагают, важна для миелинизации ЦНС [70]. При сравнении со многими другими миелиновыми белками CNPase появляется на ранней стадии развития в олигодендроцитах и продолжает экспрессирваться в олигодендроцитах взрослых животных [71]. CNPase крепится к мембране и может связывать тубулин с мембраной, а также может регулировать цитоплазматическое распределение микротрубочек [72].

Маркеры микрососудов
Эндотелиальный барьерный антиген (EBA)

Общие морфологические характеристики отличают эндотелиальные клетки микрососудов. Тем не менее, маркер микрососудов EBA может быть использован, чтобы окончательно установить идентичность этих клеток. В отличие от других маркеров сосудов ЕВА является иммуногистохимическим маркером микрососудов центральной нервной системы, то есть, он избирательно экспрессируется в нервной системе. Сам белок находится в плазматической мембране эндотелиальных клеток микрососудов. Экспрессия EBA значительно снижается при черепно-мозговых травмах в области ушиба и нарушениях гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). В настоящее время роль EBA в функции ГЭБ до конца не изучена. Однако исследования на крысах показали, что иммунологическая нейтрализация EBA приводит к нарушению ГЭБ, что указывает на его важность в поддержании целостности ГЭБ [73].

Выбирая подходящий иммуногистохимический маркер

Выбор подходящего нейронального маркера зависит от цели конкретного исследования. В тех случаях, когда основной целью является установление нейронального фенотипа, могут быть использованы такие маркеры, как NeuN и MAP-2. Антитела к этим маркерам широко используются, и они очень хорошо охарактеризованы [28, 31, 33, 74]. Хотя любой из этих маркеров может быть использован в исследованиях, требующих оценки общего числа нейронов или нейронной плотности, NeuN для этих целей используется чащи. Это, вероятно, связано с его компактным паттерном ядерного окрашивания, который является более благоприятным для сбора количественных данных, чем более дисперсное дендритное окрашивание MAP-2. Кроме того, учитывая, что программы для подсчета клеток обычно используют автоматизированные алгоритмы обнаружения, высокая контрастность (то есть, отношение сигнал к шуму) в результате компактной окраски здесь будет кстати.

МаркерUniprot accessionID генаЧисло публикацийГлавные три поставщика
NSE P09104 811 Dako (3), Life Technologies Corporation (2), Thermo Scientific Pierce Products (1)
NeuN A6NFN3 98 EMD Millipore (8), Dako (1)
MAP2 P11137 3648 Sigma-Aldrich (15), EMD Millipore (11), BD Biosciences (3)
Tuj1 Q13015 67BioLegend (4), EMD Millipore (1), Sigma-Aldrich (1)
DCX O43602 66 Santa Cruz Biotechnology (5), EMD Millipore (1)
GFAP P14136 8085 Dako (35), Sigma-Aldrich (19), EMD Millipore (12)
S100beta P04271 1820Dako (10), Life Technologies Corporation (2), Sigma-Aldrich (2)
vimentin P08670 6171 Dako (23), Sigma-Aldrich (13), Santa Cruz Biotechnology (4)
CNPase P09543 89 Sigma-Aldrich (2), Abcam (1), Thermo Scientific Pierce Products (1)
Таблица 2. Число публикаций, цитирующих использование иммуногистохимических маркеров нейрональных и глиальных клеток среди 10,113 публикаций, скинированных Labome.

Иногда исследование может ставить цели, которые налагают дополнительные требования к маркеру. Например, когда нейроны должны быть далее охарактеризованы на основании их ассоциации со специфическим нейромедиатором, могут быть использованы антитела к рецепторам для нейромедиатора или нейротрансмиттер-ассоциированным ферментам. Такие антитела широко доступны, в том числе те, которые метят глутаматергические, ГАМКергические, холинергические или серотонинергические нейроны. В других случаях может потребоваться маркер, который совместим с использованием других иммуногистохимических маркеров или других методологий. Это часто бывает в исследованиях нейрогенеза, которое обычно включают в себя комбинированное мечение клеток маркерами пролиферации, такими как бромдеоксиуридин или мечение тритием тимидина, и нейрональными маркерами. Кроме того, в зависимости от сроков деления клеток, данные исследования обычно требуют маркеры, которые экспрессируются в определенное время после выхода из клеточного цикла. Поскольку экспрессия белка зависит от стадии дифференцировки клеток, выбор маркера будет существенно влиять на количество идентифицированных новых нейронов. В ситуациях, когда скорость, с которой новорожденные клетки дифференцируются, варьирует между группами, может потребоваться набор маркеров для определения различий между нейронами на разных стадиях дифференцировки.

Помимо определения нейронального фенотипа иммуногистохимические маркеры могут также дать информацию о морфологических характеристиках нейронов. Нейрон-специфические антитела могут быть полезны для определения цитоархитектуры. Однако окрашивание зависит от распределения белка-мишени в клетке и будет варьировать между ядром, сомой, дендритами и аксоном. Таким образом, тип информации, которая может быть получена, зависит от локализации белка-мишени. В одном из исследований использовались антитела к типу нейрофиламента, присутствующего в дендритном дереве, чтобы подтвердить данные, указывающие на изменения в дендритных разветвлениях [75]. Интересной разработкой стало введение пан-нейрональных маркеров, которые включают в себя комбинацию маркеров, которые позволяют визуализировать сразу всю цитоархитектуру нейрона.

Технические аспекты

Тип микроскопии, используемый для анализа иммунноокрашивания, частично определяет возможности различных маркеров. Преимущество световой микроскопии в очень простом оборудовании, и большинство исследователей имеют доступ к нему. Кроме того, иммунноокрашивание ткани, подготовленной для световой микроскопии, является относительно стабильным и не подлежит обесцвечиванию в течение сбора данных. Тем не менее, световая микроскопия ограничена в оптическом разрешении по сравнению с другими методами микроскопии и не обеспечивает четкого визуального различия между мечением в той же плоскости и перекрывающимся окрашиванием. Таким образом, крайне важно, чтобы маркеры были локализованы в разных областях клетки при оценке совместного мечения.

Вообще говоря, совместное окрашивание нескольких антигенов с использованием иммуногистохимических маркеров лучше всего достигается с помощью флуоресцентной микроскопии. Позволяя также идентифицировать совместные маркеры в плоскости XY, этот тип микроскопии позволяет сгенерировать ряд последовательный изображений нескольких слоев для верификации того, что маркеры колокализованы в пределах плоскости YZ (Рисунок 5). Наиболее существенным недостатком, связанным с использованием флуоресцентного мечения, является то, что оно не является постоянным. Просмотр ткани в течение длительного времени вызывает фотообесцвечивание и угасание флуоресценции. Точно так же конфокальная лазерная сканирующая микроскопия вызывает фотообесцвечивание с каждым проходом так, что может быть выполнено только ограниченное сканирование одного и того же поля. К счастью, с самыми последними поколениями флюорохромов это стало менее важной проблемой. На самом деле, ряд антител к нейрональных маркерам доступны в формах, конъюгированных с очень надежеными флуорохромами, такими как Alexa-488 и Alexa-555.

Маркеры нейрональных клеток Рисунок 5
Рисунок 5. Конфокальные изображения клеток с двойным окрашиванием нестина (зеленый) и βIII-тубулина (красный) в головном мозге взрослых крыс. Взято из [80].

Другим важным фактором является средство, с помощью которого экспериментальная ткань консервировалась и обрабатывалась для анализа. Эффективное окрашивания некоторых антител зависит от того, был ли образец залит парафином и от типа химического фиксатора, который использовался для консервации. Поставщики иногда предлагают ряд антител к одному и тому же антигену, которые различаются пригодностью для конкретного протокола иммуногистохимии. Кроме того, исследователи могут также использовать ряд стратегий для повышения соотношения сигнал к шуму, в том числе с использованием сыворотки, чтобы блокировать неспецифическое связывание, или перекиси водорода, чтобы погасить эндогенные пероксидазы. В ткани, фиксированной с помощью формалина или других альдегидов, белки сшиваются таким образом, что антигенные сайты замаскированы, вызывая негативное или слабое иммунноокрашивание. Антиген-демаскирующие методы, которые нарушают эти сшивки, могут быть выполнены с использованием соляной или муравьиной кислоты, нагревания, протеолитических ферментов (протеиназы К, трипсина, пепсина, проназы, протеазы), или детергентов (SDS, тритон-X).

Хотя учет всех перечисленных факторов может способствовать успешному осуществлению иммунноокрашивания, все это не отменяет необходимости в подтверждении специфичности антител в условиях, определенных данным экспериментом. Одна из возможных стратегий заключается в том, чтобы сравнить данные иммунноокрашивания с in situ мРНК гибридизацией для белка-мишени. Такой подход ограничен проверкой совместной маркировки одних и тех же клеток, учитывая, что мРНК присутствует в теле клетки, а белок может быть расположен в другом месте. В качестве альтернативы сравнение паттерна окрашивания антителами, узнающими разные эпитопы белка, может быть использовано для проверки специфичности антител. Наиболее доказательным средством демонстрации специфичности, однако, является отсутствие окрашивания в генетически модифицированных животных моделях, в которых ген, кодирующий предполагаемый антиген, был нокаутирован (глобально или ткане-специфически).

В связи с увеличением в течение многих лет количества коммерчески доступных антител исследователи смогли отойти от необходимости разработки и проверки собственных антител. Тем не менее, следует иметь в виду, что антитела демонстрируют перекрестную реактивность с не антигенами-мишенями при использовании в высоких концентрациях или в среде, содержащей сложные белковые смеси (как это характерно для участков мозга). В конечном счете, независимо от того, насколько широко используемым или хорошо охарактеризованным является антитело, ответственность за проверку специфичности всегда ложится на плечи каждого индивидуального исследователя.

Ссылки
  1. Campbell K, Gotz M. Radial glia: multi-purpose cells for vertebrate brain development. Trends Neurosci. 2002;25:235-8 pubmed
  2. Steindler D. Neurogenic astrocytes and their glycoconjugates: not just "glue" anymore. Methods Mol Biol. 2012;814:9-22 pubmed publisher
  3. Eglitis M, Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:4080-5 pubmed
  4. Wake H, Moorhouse A, Miyamoto A, Nabekura J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 2013;36:209-17 pubmed publisher
  5. Eyo U, Dailey M. Microglia: key elements in neural development, plasticity, and pathology. J Neuroimmune Pharmacol. 2013;8:494-509 pubmed publisher
  6. Woodley D, Zelickson A, Briggaman R, Hamilton T, Weiss J, Ellis C, et al. Treatment of photoaged skin with topical tretinoin increases epidermal-dermal anchoring fibrils. A preliminary report. JAMA. 1990;263:3057-9 pubmed
  7. Llinas RR, Walton KD, Lang EJ. Cerebellum. In: Shepherd GM, editors. The Synaptic Organization of the Brain. New York: Oxford University Press; 2004.
  8. Masland R. Neuronal cell types. Curr Biol. 2004;14:R497-500 pubmed
  9. The Human Connectome Project. Available from: www.humanconnectomeproject.org/
  10. Mountcastle V, Talbot W, Sakata H, Hyvarinen J. Cortical neuronal mechanisms in flutter-vibration studied in unanesthetized monkeys. Neuronal periodicity and frequency discrimination. J Neurophysiol. 1969;32:452-84 pubmed
  11. Connors B, Gutnick M. Intrinsic firing patterns of diverse neocortical neurons. Trends Neurosci. 1990;13:99-104 pubmed
  12. Luo L. Fly MARCM and mouse MADM: genetic methods of labeling and manipulating single neurons. Brain Res Rev. 2007;55:220-7 pubmed
  13. Shimono M, Tsuji N. Study of the selectivity of the impregnation of neurons by the Golgi method. J Comp Neurol. 1987;259:122-30 pubmed
  14. Pasternak J, Woolsey T. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 1975;160:307-12 pubmed
  15. Joh T, Shikimi T, Pickel V, Reis D. Brain tryptophan hydroxylase: purification of, production of antibodies to, and cellular and ultrastructural localization in serotonergic neurons of rat midbrain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72:3575-9 pubmed
  16. Pickel V. Immunocytochemical localization of neuronal antigens: tyrosine hydroxylase, substance P, [Met5]-enkephalin. Fed Proc. 1979;38:2374-80 pubmed
  17. Schmechel D, Marangos P, Zis A, Brightman M, Goodwin F. Brain endolases as specific markers of neuronal and glial cells. Science. 1978;199:313-5 pubmed
  18. Salton S, Richter-Landsberg C, Greene L, Shelanski M. Nerve growth factor-inducible large external (NILE) glycoprotein: studies of a central and peripheral neuronal marker. J Neurosci. 1983;3:441-54 pubmed
  19. Houser C, Crawford G, Salvaterra P, Vaughn J. Immunocytochemical localization of choline acetyltransferase in rat cerebral cortex: a study of cholinergic neurons and synapses. J Comp Neurol. 1985;234:17-34 pubmed
  20. Celio M, Heizmann C. Calcium-binding protein parvalbumin as a neuronal marker. Nature. 1981;293:300-2 pubmed
  21. Borit A, Brooks T, Ordonez N, Kakulas B. Central neural antigens: detection and diagnostic application. Crit Rev Clin Lab Sci. 1986;23:219-43 pubmed
  22. Hayashi K, Motoi M, Nose S, Horie Y, Akagi T, Ogawa K, et al. An immunohistochemical study on the distribution of glial fibrillary acidic protein, S-100 protein, neuron-specific enolase, and neurofilament in medulloblastomas. Acta Pathol Jpn. 1987;37:85-96 pubmed
  23. Jefferis G, Livet J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Curr Opin Neurobiol. 2012;22:101-10 pubmed publisher
  24. Iwanaga T, Takahashi Y, Fujita T. Immunohistochemistry of neuron-specific and glia-specific proteins. Arch Histol Cytol. 1989;52:13-24 pubmed
  25. Marangos P, Schmechel D, Parma A, Goodwin F. Developmental profile of neuron-specific (NSE) and non-neuronal (NNE) enolase. Brain Res. 1980;190:185-93 pubmed
  26. Sensenbrenner M, Lucas M, Deloulme J. Expression of two neuronal markers, growth-associated protein 43 and neuron-specific enolase, in rat glial cells. J Mol Med (Berl). 1997;75:653-63 pubmed
  27. Vinores S, Marangos P, Bonnin J, Rubinstein L. Immunoradiometric and immunohistochemical demonstration of neuron-specific enolase in experimental rat gliomas. Cancer Res. 1984;44:2595-9 pubmed
  28. Mullen R, Buck C, Smith A. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 1992;116:201-11 pubmed
  29. Cannon J, Greenamyre J. NeuN is not a reliable marker of dopamine neurons in rat substantia nigra. Neurosci Lett. 2009;464:14-7 pubmed publisher
  30. Kumar S, Buckmaster P. Neuron-specific nuclear antigen NeuN is not detectable in gerbil subtantia nigra pars reticulata. Brain Res. 2007;1142:54-60 pubmed
  31. Kim K, Adelstein R, Kawamoto S. Identification of neuronal nuclei (NeuN) as Fox-3, a new member of the Fox-1 gene family of splicing factors. J Biol Chem. 2009;284:31052-61 pubmed publisher
  32. Izant J, McIntosh J. Microtubule-associated proteins: a monoclonal antibody to MAP2 binds to differentiated neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77:4741-5 pubmed
  33. Dehmelt L, Halpain S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biol. 2005;6:204 pubmed
  34. Huber G, Matus A. Differences in the cellular distributions of two microtubule-associated proteins, MAP1 and MAP2, in rat brain. J Neurosci. 1984;4:151-60 pubmed
  35. Geisert E, Johnson H, Binder L. Expression of microtubule-associated protein 2 by reactive astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87:3967-71 pubmed
  36. Lee M, Tuttle J, Rebhun L, Cleveland D, Frankfurter A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motil Cytoskeleton. 1990;17:118-32 pubmed
  37. Geisert E, Frankfurter A. The neuronal response to injury as visualized by immunostaining of class III beta-tubulin in the rat. Neurosci Lett. 1989;102:137-41 pubmed
  38. Francis F, Koulakoff A, Boucher D, Chafey P, Schaar B, Vinet M, et al. Doublecortin is a developmentally regulated, microtubule-associated protein expressed in migrating and differentiating neurons. Neuron. 1999;23:247-56 pubmed
  39. Friocourt G, Koulakoff A, Chafey P, Boucher D, Fauchereau F, Chelly J, et al. Doublecortin functions at the extremities of growing neuronal processes. Cereb Cortex. 2003;13:620-6 pubmed
  40. Bullitt E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 1990;296:517-30 pubmed
  41. Oka Y, Ye M, Zuker C. Thirst driving and suppressing signals encoded by distinct neural populations in the brain. Nature. 2015;520:349-52 pubmed publisher
  42. Ikonomovic M, Abrahamson E, Isanski B, Wuu J, Mufson E, DeKosky S. Superior frontal cortex cholinergic axon density in mild cognitive impairment and early Alzheimer disease. Arch Neurol. 2007;64:1312-7 pubmed
  43. Benzing W, Mufson E, Armstrong D. Immunocytochemical distribution of peptidergic and cholinergic fibers in the human amygdala: their depletion in Alzheimer's disease and morphologic alteration in non-demented elderly with numerous senile plaques. Brain Res. 1993;625:125-38 pubmed
  44. Yamada M, Chiba T, Sasabe J, Terashita K, Aiso S, Matsuoka M. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 2008;33:2020-32 pubmed
  45. Engelhardt J, Le W, Siklos L, Obal I, Boda K, Appel S. Stereotaxic injection of IgG from patients with Alzheimer disease initiates injury of cholinergic neurons of the basal forebrain. Arch Neurol. 2000;57:681-6 pubmed
  46. Perez S, Dar S, Ikonomovic M, DeKosky S, Mufson E. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiol Dis. 2007;28:3-15 pubmed
  47. Fujishiro H, Umegaki H, Isojima D, Akatsu H, Iguchi A, Kosaka K. Depletion of cholinergic neurons in the nucleus of the medial septum and the vertical limb of the diagonal band in dementia with Lewy bodies. Acta Neuropathol. 2006;111:109-14 pubmed
  48. Kubis N, Faucheux B, Ransmayr G, Damier P, Duyckaerts C, Henin D, et al. Preservation of midbrain catecholaminergic neurons in very old human subjects. Brain. 2000;123:366-73 pubmed
  49. Yoon M, Shin M, Kim T, Kim B, Ko I, Sung Y, et al. Treadmill exercise suppresses nigrostriatal dopaminergic neuronal loss in 6-hydroxydopamine-induced Parkinson's rats. Neurosci Lett. 2007;423:12-7 pubmed
  50. Taravini I, Chertoff M, Cafferata E, Courty J, Murer M, Pitossi F, et al. Pleiotrophin over-expression provides trophic support to dopaminergic neurons in parkinsonian rats. Mol Neurodegener. 2011;6:40 pubmed
  51. Gascon E, Vutskits L, Kiss J. Polysialic acid-neural cell adhesion molecule in brain plasticity: from synapses to integration of new neurons. Brain Res Rev. 2007;56:101-18 pubmed
  52. Chae J, Stein G, Lee J. NeuroD: the predicted and the surprising. Mol Cells. 2004;18:271-88 pubmed
  53. Shin R, Iwaki T, Kitamoto T, Tateishi J. Hydrated autoclave pretreatment enhances tau immunoreactivity in formalin-fixed normal and Alzheimer's disease brain tissues. Lab Invest. 1991;64:693-702 pubmed
  54. Pooler A, Hanger D. Functional implications of the association of tau with the plasma membrane. Biochem Soc Trans. 2010;38:1012-5 pubmed publisher
  55. Bastianelli E. Distribution of calcium-binding proteins in the cerebellum. Cerebellum. 2003;2:242-62 pubmed
  56. Arenzana F, Santos-Ledo A, Porteros A, Aijon J, Velasco A, Lara J, et al. Characterisation of neuronal and glial populations of the visual system during zebrafish lifespan. Int J Dev Neurosci. 2011;29:441-9 pubmed publisher
  57. Portier M, Escurat M, Landon F, Djabali K, Bousquet O. Peripherin and neurofilaments: expression and role during neural development. C R Acad Sci III. 1993;316:1124-40 pubmed
  58. Eng L, Ghirnikar R, Lee Y. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 2000;25:1439-51 pubmed
  59. Kamphuis W, Mamber C, Moeton M, Kooijman L, Sluijs J, Jansen A, et al. GFAP isoforms in adult mouse brain with a focus on neurogenic astrocytes and reactive astrogliosis in mouse models of Alzheimer disease. PLoS ONE. 2012;7:e42823 pubmed publisher
  60. Mamber C, Kamphuis W, Haring N, Peprah N, Middeldorp J, Hol E. GFAPδ expression in glia of the developmental and adolescent mouse brain. PLoS ONE. 2012;7:e52659 pubmed publisher
  61. Polito A, Reynolds R. NG2-expressing cells as oligodendrocyte progenitors in the normal and demyelinated adult central nervous system. J Anat. 2005;207:707-16 pubmed
  62. Zhu X, Zuo H, Maher B, Serwanski D, LoTurco J, Lu Q, et al. Olig2-dependent developmental fate switch of NG2 cells. Development. 2012;139:2299-307 pubmed publisher
  63. Bianchi R, Adami C, Giambanco I, Donato R. S100B binding to RAGE in microglia stimulates COX-2 expression. J Leukoc Biol. 2007;81:108-18 pubmed
  64. Deinum J, Baudier J, Briving C, Rosengren L, Wallin M, Gerard D, et al. The effect of S-100a and S-100b proteins and Zn2+ on the assembly of brain microtubule proteins in vitro. FEBS Lett. 1983;163:287-91 pubmed
  65. Ivaska J, Pallari H, Nevo J, Eriksson J. Novel functions of vimentin in cell adhesion, migration, and signaling. Exp Cell Res. 2007;313:2050-62 pubmed
  66. Jiang S, Slinn J, Aylsworth A, Hou S. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. J Neurochem. 2012;122:764-74 pubmed publisher
  67. Wang K, Bekar L, Furber K, Walz W. Vimentin-expressing proximal reactive astrocytes correlate with migration rather than proliferation following focal brain injury. Brain Res. 2004;1024:193-202 pubmed
  68. Levin E, Acharya N, Sedeyn J, Venkataraman V, D'Andrea M, Wang H, et al. Neuronal expression of vimentin in the Alzheimer's disease brain may be part of a generalized dendritic damage-response mechanism. Brain Res. 2009;1298:194-207 pubmed publisher
  69. Sprinkle T. 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase, an oligodendrocyte-Schwann cell and myelin-associated enzyme of the nervous system. Crit Rev Neurobiol. 1989;4:235-301 pubmed
  70. Gravel M, Peterson J, Yong V, Kottis V, Trapp B, Braun P. Overexpression of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase in transgenic mice alters oligodendrocyte development and produces aberrant myelination. Mol Cell Neurosci. 1996;7:453-66 pubmed
  71. Trapp B, Bernier L, Andrews S, Colman D. Cellular and subcellular distribution of 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase and its mRNA in the rat central nervous system. J Neurochem. 1988;51:859-68 pubmed
  72. Bifulco M, Laezza C, Stingo S, Wolff J. 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase: a membrane-bound, microtubule-associated protein and membrane anchor for tubulin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99:1807-12 pubmed
  73. Ghabriel M, Zhu C, Hermanis G, Allt G. Immunological targeting of the endothelial barrier antigen (EBA) in vivo leads to opening of the blood-brain barrier. Brain Res. 2000;878:127-35 pubmed
  74. Goedert M, Crowther R, Garner C. Molecular characterization of microtubule-associated proteins tau and MAP2. Trends Neurosci. 1991;14:193-9 pubmed
  75. Qu J, Matsouaka R, Betensky R, Hyman B, Grosskreutz C. Calcineurin activation causes retinal ganglion cell degeneration. Mol Vis. 2012;18:2828-38 pubmed
  76. Portiansky E, Nishida F, Barbeito C, Gimeno E, Goya R. Increased number of neurons in the cervical spinal cord of aged female rats. PLoS ONE. 2011;6:e22537 pubmed publisher
  77. Peter M, Bathellier B, Fontinha B, Pliota P, Haubensak W, Rumpel S. Transgenic mouse models enabling photolabeling of individual neurons in vivo. PLoS ONE. 2013;8:e62132 pubmed publisher
  78. Merz K, Lie D. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS ONE. 2013;8:e62693 pubmed publisher
  79. Cerbai F, Lana D, Nosi D, Petkova-Kirova P, Zecchi S, Brothers H, et al. The neuron-astrocyte-microglia triad in normal brain ageing and in a model of neuroinflammation in the rat hippocampus. PLoS ONE. 2012;7:e45250 pubmed publisher
  80. Hendrickson M, Rao A, Demerdash O, Kalil R. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS ONE. 2011;6:e18535 pubmed publisher
ISSN : 2329-5139