Структура и фрагменты антител
Mary Johnson (han at labome dot com)
Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Перевод
Алексей Степаненко (a dot a dot stepanenko at gmail dot com)
Институт молекулярной биологии и генетики
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.ru.3.160
Дата
последнего обновления : 2016-10-17; оригинальная версия : 2013-12-21
Цитировать как
MATER METHODS ru 2013;3:160
Абстракт

Подробное описание структуры антител и различных фрагментов, а также их основные применения

English Abstract

An in-depth description of antibody structure and various fragments, as well as their major applications.

Традиционные антитела

Традиционные или полноразмерные антитела представляют собой гликопротеины, называемые иммуноглобулинами, которые вырабатываются плазматическими клетками в ответ на чужеродные молекулы (иммуногены). Основная функция антител – специфически связываться с антигеном и вызывать иммунный ответ, таким образом, защищая организм от инфекции. Есть несколько классов антител, но этот обзор посвящен антителам класса IgG и IgM, которые в основном используются в исследованиях, диагностических и терапевтических биомедицинских целях.

Традиционная структура антител

Основной единицей полного антитела является четырех полипептидная единица, которая содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи, скрепленные вместе с помощью дисульфидных связей. Антитело по форме представляет собой Y и имеет гибкую шарнирную область. Каждая полипептидная цепь имеет константную область, которая очень похожа во всех антителах, и вариабельный участок, который является специфическим для каждого конкретного антитела. Общее обозначение для вариабельной области легкой цепи - VL и для константной области легкой цепи - CL (Рисунок 1 левая панель). Обозначения аналогичны для переменной тяжелой цепи (VH) и константной области (CH). Углеводы, как правило, присоединены к домену СН2 тяжелых цепей. Фрагмент кристаллизующая область (Fc) содержит только константные области тяжелых цепей (СН), тогда как фрагмент антиген-связывающий участок (FAB) включает в себя как константный домен, так и вариабельный домен тяжелой и легкой цепей (VH и CL ). Фрагмент вариабельной области Fv содержит только два вариабельных домена (Рисунок 1). См антитело мыши для обсуждения изотипов иммуноглобулинов, подклассов и числа иммуноглобулиновых доменов

Структура и фрагменты антител Рисунок 1
Рисунок 1. Базовая структура традиционных полноразмерных антител (левая панель) и общих фрагментов антител (правая панель). Из [51]
Традиционное применение антител

Традиционные антитела используются в исследованиях для обнаружения белков в Вестерн-блот анализе [2], иммуногистохимии [3] и иммуноферментном анализе (ELISA) [4] в течение десятилетий. Полноразмерные антитела также используются для диагностических целей, таких как тесты на беременность, обнаружение бактерий и вирусов в крови. Кроме того, традиционные антитела используются в терапии заболеваний. Например, инфликсимаб является одним из доступных антител, которое распознает фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и используется при лечении болезни Крона и ревматоидного артрита [5, 6]. Трастузумаб, или Герцептин, представляет собой антитело, используемое при лечении метастатического рака молочной железы, связываясь с рецептором эпидермального фактора роста 2 [7]. Кроме того, существует несколько методов лечения на основе антител, которые дают реципиенту трансплантата для предотвращения его отторжения, в том числе Muromomab [8].

Преимуществом использования традиционных антител является то, что Fc область вызывает иммунный ответ организма и связанные молекулы приводит к разрушению. Недостатком полноразмерных антител является их неспособность проникать в определенные ткани из-за их относительно большого размера [9]. Недостатком использования полноразмерных антител в клинической практике является то, что домен Fc часто вызывает иммунный ответ, который может быть вредным для здоровья пациента. Домен Fc часто приводит к значительным неспецифическим связываниям.

Фрагменты антител

Фрагменты антител могут быть получены с помощью химических или генетических подходов. Химическая фрагментация использует восстановители, чтобы разорвать дисульфидные связи в шарнирной области, и разрезание антитела протеазами, в том числе пепсином, папаином и фицином. Генетическая конструкция фрагментов дает возможность создавать множество фрагмент-содержащих молекул, каждая с уникальными связующими и функциональными характеристиками.

Fab, Fab', (Fab')2, и Fv

Химическая и протеазная обработка полноразмерных антител дает антиген связывающий фрагмент (Fab), который генерируется из вариабельных областей антител класса IgG и IgM (рисунок 1, правая панель). Fc-фрагмент, состоящий только из константных областей тяжелой цепи, удаляется из Fab. Антиген-связывающий фрагмент включает фрагменты Fab, Fab', (Fab')2 и Fv. Эти фрагменты способны связываться с антигеном, но они не имеют Fc-области, которая содержит константные домены 2 и 3 тяжелой цепи. Два индивидуальных F(аb) фрагмента отделяются от Fc-области, когда полноразмерное антитело расщепляют с помощью фермента папаина. Тем не менее, F(ab')2-фрагмент, который сохраняет небольшую часть шарнирной области Fc, отделяется от остальной части Fc-области антитела обработкой пепсином. Хотя использование биохимических методов для создания фрагментов антител дает полезные инструменты для диагностических и терапевтических применений, они достаточно трудоемкие и требуют большое количества исходного материала.

Моновалентные F(ab) фрагменты имеют один антиген-связывающий сайт, тогда как двухвалентные F(ab')2 -фрагменты имеют две антигенсвязывающие области, которые связаны дисульфидными связями. Уменьшение F(ab')2 фрагментов дает 2 моновалентных Fab' фрагмента, которые имеют свободную сульфгидрильную группу, которая используется для конъюгации с другими молекулами.

Fv фрагмент – это наименьший фрагмент, получаемый в результате ферментативного расщепления антител класса IgG и IgM. Fv фрагмент имеет антиген-связывающий сайт, состоящий из областей VH и ВК, но отсутствуют CH1 и CL области (Рисунок 1 правая панель). Цепи VH и VL удерживаются вместе в Fv фрагменте нековалентными взаимодействиями.

ScFv, диатела, триатела, тетратела, Bis-scFv, минитела, Fab2, Fab3

Методы генной инженерии позволяют получать вариабельные одноцепочечные фрагменты (ScFv), которые представляют собой фрагменты типа Fv и включают домены VH и VL, соединенные гибким пептидом (Рисунок 1, правая панель) [10]. Когда линкер имеет длину по меньшей мере 12 остатков, фрагменты ScFv в основном мономерные [11]. Манипуляция ориентации V-доменов и длины линкера создает различные формы молекул Fv [11]. Линкеры, которые в длину 3-11 остатков, дают ScFv молекулы, которые не могут фолдировать в функциональный домен Fv. Эти молекулы связываются со второй молекулой ScFv, создавая двухвалентное диатело [12]. Если длина линкера составляет менее трех остатков, молекулы ScFv объединяться в тритела или тетратела. Мультивалентные scFvs обладают большей функциональной аффинностью связывания со своими антигенами-мишенями, чем их аналоги одновалентные из-за связывания с двумя антигенами-мишенями, что уменьшает скорость диссоциации фрагмента антитела [13]. Минитела представляют собой ScFv-СН3 слитые белки, которые собираются в двухвалентные димеры. Бис-ScFv фрагменты биспецифические [14]. Миниатюрные фрагменты ScFv могут быть сгенерированы с содержанием двух различных вариабельных доменов, что позволяет этим Бис-ScFv молекулам одновременно связываться с двумя различными эпитопами. Генетические методы также используются для создания биспецифических (Fab-димеров) и Fab2 триспецифических Fab тримеров (Fab3). Эти фрагменты антител способны связываться с 2 (Fab2) или 3 (Fab3) различными антигенами сразу.

Камелидные антитела и нанотела

В дополнение к обычным антителам, камелидные антитела содержат набор специфических Heavy Chain Antibodies (hcAb), исключительно состоящих из гомодимера тяжелых цепей и не имеют легких цепей [15]. Fab часть этих антител называется VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), является наименьшей антиген-связывающей областью, найденной в природе [16]. Нанотела представляют собой рекомбинантные домены из VHH, способные связывать антигены. Они очень стабильны и легко могут быть получены в огромном количестве с помощью традиционных систем, таких как бактерии и, таким образом, представляет собой перспективный инструмент для исследований и терапевтических целей. Нанотела также могут быть экспрессированы непосредственно in vivo. Например, анти-GFP нанотело используется для разработки электромагнитной системы управления для нейрональной активности in vivo [17].

Коровьи ультрадлинные CDR3H
Применение фрагментов антител

Фрагменты имеют преимущества по сравнению с полноразмерными антителами для некоторых целей. Эта тема недавно была рассмотрена Нельсоном [21]. Одним из преимуществ фрагментов является то, что фрагменты достаточно малы, чтобы проникать в ткани, в которые полноразмерные антитела не могут проникать. Это преимущество используется в терапевтических и иммуногистохимических процедурах [9]. Фрагменты антител, как правило, не имеют гликозилирования, что позволяет их производить в прокариотических системах экспрессии. Однако фрагменты, которые не имеют Fc домен, деградируют в организме гораздо быстрее, чем обычные антитела [22], и не способны вызывать Fc-опосредованный цитотоксический процесс, если они не конъюгированы с эффекторным фрагментом [23], что требует дальнейшей оптимизации при использовании терапии на основе фрагментов антител. Тем не менее, отсутствие домена Fc является существенным преимуществом для первичных антител, используемых в иммуногистохимических и других целях, так как они значительно уменьшают неспецифическое связывание с рецептором Fc. Фрагменты антител, которые без Fc-области, имеют редуцированное неспецифическое связывание. Один из ScFv, который обычно используется для диагностики, является NC10 антитело против нейраминидазы вируса гриппа. МОС-31 антитело против эпителиальной молекулы клеточной адгезии Ep-CAM является ScFv, широко используемым в терапии рака. Диантитела, триантитела и тетраантитела имеют потенциальное применение в радиоиммунотерапии и диагностической визуализации in vivo [24]. Нанотела могут быть использованы для коиммунопреципитации или в сочетании с флуоресцентными белками для отслеживания в реальном времени внутриклеточных мишеней в живых клетках [25].

Хотя различные фрагменты антител обладают определенными преимуществами, они обычно не используются в экспериментах. В 38430 статьях, проанализированных Labome на март 2016 года, только несколько статей цитируют применения Fab фрагментов антител. Roche анти-дигоксигенин Fab-фрагменты использовали в соотношении 1:1000 или 1:2000 для выполнения in situ гибридизации для демонстрации того, что главное проксимодистальное подразделение конечностей зависит от диффундирующих сигналов [26], цилиогенез регулируется с помощью эволюционно собранного цис-регуляторного модуля [27], и эволюцию миметического паттерна крыла бабочки можно регулировать с помощью гена Optix [28]. Их также использовали для анализа фолдинга белка, чтобы изучить процесс фолдинга одной одиночной молекулы кальмодулина с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии [29]. Rochе анти-дигоксигенин антитела (каталожный номер 11093274910) были получены в овце и производятся путем расщепления с помощью папаина. Roche антифлуоресцентная щелочная фосфатаза Fab-фрагменты использовали в Саузерн-блоттинге для изучения функции топоизомеразы II [30]. Более поздние примеры использования Roche анти-дигоксигенин или антифлуоресцентного Fab реагента включают исследования, описывающие паттерн экспрессии для нейронального коннексина 35b [31], исследования апоптической гибели клеток у эмбриона дрозофилы, яичника и культивируемых линии клеток [32], для тестирования, регулируется ли синаптическая GluA2 концентрация путем транспортировки белка или локальной трансляцией [33], для изучения связи между формированием коры головного мозга человека и нарушением sonic hedgehog сигналинга [34], исследования механизма, лежащего в основе бегущих волн экспрессии clock-генов во время развития [35], исследования того, как взаимодействие между TRF2 и ламином А/C регулирует структуру хромосом [36], изучения сигнальных путей, которые связывают специфические подтипы нейронов у мышей во время развития [37], среди других [38-48].

Invitrogen Alexa 546-конъюгированные антитела осла против кроличьего IgG Fab-фрагмента были использованы в иммуногистохимии, чтобы исследовать роль sFLT-1 в поддержании аваскулярного фоторецепторного слоя в мышиных моделях [49], и Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab')2 фрагмент кролика против козьего IgG (H + L) был использован в иммуногистохимии для изучения механизма регенерации в связи слуховых волосяных клеток [50].

Ссылки
  1. Dunbar J, Krawczyk K, Leem J, Baker T, Fuchs A, Georges G, et al. SAbDab: the structural antibody database. Nucleic Acids Res. 2014;42:D1140-6 pubmed publisher
  2. Renart J, Reiser J, Stark G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:3116-20 pubmed
  3. Matthews J. Immunocytochemical methods: a technical overview. J Oral Pathol. 1987;16:189-95 pubmed
  4. Lequin R. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clin Chem. 2005;51:2415-8 pubmed
  5. Keyashian K, Annunziata M, Sakuraba A, Hanauer S. Management of inflammatory bowel disease: past, present and future. Expert Rev Clin Immunol. 2012;8:303-5 pubmed
  6. Miller A, Ranatunga S. Immunotherapies in rheumatologic disorders. Med Clin North Am. 2012;96:475-96, ix-x pubmed publisher
  7. Shepard H, Jin P, Slamon D, Pirot Z, Maneval D. Herceptin. Handb Exp Pharmacol. 2008;:183-219 pubmed
  8. Goldstein G. Overview of the development of Orthoclone OKT3: monoclonal antibody for therapeutic use in transplantation. Transplant Proc. 1987;19:1-6 pubmed
  9. Jain R. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors. Cancer Res. 1990;50:814s-819s pubmed
  10. Bird R, Hardman K, Jacobson J, Johnson S, Kaufman B, Lee S, et al. Single-chain antigen-binding proteins. Science. 1988;242:423-6 pubmed
  11. Hudson P, Kortt A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. J Immunol Methods. 1999;231:177-89 pubmed
  12. Holliger P, Prospero T, Winter G. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:6444-8 pubmed
  13. Kortt A, Lah M, Oddie G, Gruen C, Burns J, Pearce L, et al. Single-chain Fv fragments of anti-neuraminidase antibody NC10 containing five- and ten-residue linkers form dimers and with zero-residue linker a trimer. Protein Eng. 1997;10:423-33 pubmed
  14. Holliger P, Hudson P. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol. 2005;23:1126-36 pubmed
  15. Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 2013;82:775-97 pubmed publisher
  16. Fridy P, Li Y, Keegan S, Thompson M, Nudelman I, Scheid J, et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Methods. 2014;11:1253-60 pubmed publisher
  17. Stanley S, Kelly L, Latcha K, Schmidt S, Yu X, Nectow A, et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 2016;531:647-50 pubmed publisher
  18. Saini S, Allore B, Jacobs R, Kaushik A. Exceptionally long CDR3H region with multiple cysteine residues in functional bovine IgM antibodies. Eur J Immunol. 1999;29:2420-6 pubmed
  19. Shojaei F, Saini S, Kaushik A. Unusually long germline DH genes contribute to large sized CDR3H in bovine antibodies. Mol Immunol. 2003;40:61-7 pubmed
  20. Stanfield, RL et al. Conservation and diversity in the ultralong third heavy-chain complementarity-determining region of bovine antibodies. Science Immunology 14 Jul 2016:aaf7962.
  21. Nelson A. Antibody fragments: hope and hype. MAbs. 2010;2:77-83 pubmed
  22. Cumber A, Ward E, Winter G, Parnell G, Wawrzynczak E. Comparative stabilities in vitro and in vivo of a recombinant mouse antibody FvCys fragment and a bisFvCys conjugate. J Immunol. 1992;149:120-6 pubmed
  23. Sanz L, Cuesta A, Compte M, Alvarez-Vallina L. Antibody engineering: facing new challenges in cancer therapy. Acta Pharmacol Sin. 2005;26:641-8 pubmed
  24. Robinson M, Shaller C, Garmestani K, Plascjak P, Hodge K, Yuan Q, et al. Effective treatment of established human breast tumor xenografts in immunodeficient mice with a single dose of the alpha-emitting radioisotope astatine-211 conjugated to anti-HER2/neu diabodies. Clin Cancer Res. 2008;14:875-82 pubmed publisher
  25. Maier J, Traenkle B, Rothbauer U. Real-time analysis of epithelial-mesenchymal transition using fluorescent single-domain antibodies. Sci Rep. 2015;5:13402 pubmed publisher
  26. Roselló-Díez A, Ros M, Torres M. Diffusible signals, not autonomous mechanisms, determine the main proximodistal limb subdivision. Science. 2011;332:1086-8 pubmed publisher
  27. Lee J, Silhavy J, Lee J, Al-Gazali L, Thomas S, Davis E, et al. Evolutionarily assembled cis-regulatory module at a human ciliopathy locus. Science. 2012;335:966-9 pubmed publisher
  28. Reed R, Papa R, Martin A, Hines H, Counterman B, Pardo-Diaz C, et al. optix drives the repeated convergent evolution of butterfly wing pattern mimicry. Science. 2011;333:1137-41 pubmed publisher
  29. Stigler J, Ziegler F, Gieseke A, Gebhardt J, Rief M. The complex folding network of single calmodulin molecules. Science. 2011;334:512-6 pubmed publisher
  30. Baxter J, Sen N, Martínez V, De Carandini M, Schvartzman J, Diffley J, et al. Positive supercoiling of mitotic DNA drives decatenation by topoisomerase II in eukaryotes. Science. 2011;331:1328-32 pubmed publisher
  31. Carlisle T, Ribera A. Connexin 35b expression in the spinal cord of Danio rerio embryos and larvae. J Comp Neurol. 2014;522:861-75 pubmed publisher
  32. Sarkissian T, Timmons A, Arya R, Abdelwahid E, White K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 2014;68:89-96 pubmed publisher
  33. Ho V, Dallalzadeh L, Karathanasis N, Keles M, Vangala S, Grogan T, et al. GluA2 mRNA distribution and regulation by miR-124 in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 2014;61:1-12 pubmed publisher
  34. Radonjić N, Memi F, Ortega J, Glidden N, Zhan H, Zecevic N. The Role of Sonic Hedgehog in the Specification of Human Cortical Progenitors In Vitro. Cereb Cortex. 2016;26:131-43 pubmed publisher
  35. Ay A, Holland J, Sperlea A, Devakanmalai G, Knierer S, Sangervasi S, et al. Spatial gradients of protein-level time delays set the pace of the traveling segmentation clock waves. Development. 2014;141:4158-67 pubmed publisher
  36. Wood A, Rendtlew Danielsen J, Lucas C, Rice E, Scalzo D, Shimi T, et al. TRF2 and lamin A/C interact to facilitate the functional organization of chromosome ends. Nat Commun. 2014;5:5467 pubmed publisher
  37. Sanz E, Quintana A, Deem J, Steiner R, Palmiter R, McKnight G. Fertility-regulating Kiss1 neurons arise from hypothalamic POMC-expressing progenitors. J Neurosci. 2015;35:5549-56 pubmed publisher
  38. Ge S, Li Z, Tang J, Ma Y, Hioki H, Zhang T, et al. Differential expression of VGLUT1 or VGLUT2 in the trigeminothalamic or trigeminocerebellar projection neurons in the rat. Brain Struct Funct. 2014;219:211-29 pubmed publisher
  39. Arguello A, Ye X, Bozdagi O, Pollonini G, Tronel S, Bambah-Mukku D, et al. CCAAT enhancer binding protein δ plays an essential role in memory consolidation and reconsolidation. J Neurosci. 2013;33:3646-58 pubmed publisher
  40. Lim J, Choi S, Yoo H, Cho S, Son Y, Kang C. Crlz-1 is prominently expressed in spermatogonia and Sertoli cells during early testis development and in spermatids during late spermatogenesis. J Histochem Cytochem. 2013;61:522-8 pubmed publisher
  41. Jacobi C, Rudigier L, Scholz H, Kirschner K. Transcriptional regulation by the Wilms tumor protein, Wt1, suggests a role of the metalloproteinase Adamts16 in murine genitourinary development. J Biol Chem. 2013;288:18811-24 pubmed publisher
  42. Miranda-Angulo A, Byerly M, Mesa J, Wang H, Blackshaw S. Rax regulates hypothalamic tanycyte differentiation and barrier function in mice. J Comp Neurol. 2014;522:876-99 pubmed publisher
  43. Savard A, Lavoie K, Brochu M, Grbic D, Lepage M, Gris D, et al. Involvement of neuronal IL-1β in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 2013;10:110 pubmed publisher
  44. de Oliveira J, de Matos A, Barros R, Ribeiro C, Chen A, Hespanhol V, et al. Differential expression of galectin-1 and galectin-3 in canine non-malignant and malignant mammary tissues and in progression to metastases in mammary tumors. Anticancer Res. 2014;34:2211-21 pubmed
  45. Pérez-Fernández J, Stephenson-Jones M, Suryanarayana S, Robertson B, Grillner S. Evolutionarily conserved organization of the dopaminergic system in lamprey: SNc/VTA afferent and efferent connectivity and D2 receptor expression. J Comp Neurol. 2014;522:3775-94 pubmed publisher
  46. Eilertsen M, Drivenes O, Edvardsen R, Bradley C, Ebbesson L, Helvik J. Exorhodopsin and melanopsin systems in the pineal complex and brain at early developmental stages of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus). J Comp Neurol. 2014;522:4003-22 pubmed publisher
  47. Diotel N, Rodriguez Viales R, Armant O, März M, Ferg M, Rastegar S, et al. Comprehensive expression map of transcription regulators in the adult zebrafish telencephalon reveals distinct neurogenic niches. J Comp Neurol. 2015;523:1202-21 pubmed publisher
  48. Dennison C, King C, Dicken M, Hentges S. Age-dependent changes in amino acid phenotype and the role of glutamate release from hypothalamic proopiomelanocortin neurons. J Comp Neurol. 2016;524:1222-35 pubmed publisher
  49. Luo L, Uehara H, Zhang X, Das S, Olsen T, Holt D, et al. Photoreceptor avascular privilege is shielded by soluble VEGF receptor-1. elife. 2013;2:e00324 pubmed publisher
  50. Indzhykulian A, Stepanyan R, Nelina A, Spinelli K, Ahmed Z, Belyantseva I, et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 2013;11:e1001583 pubmed publisher
  51. Joosten V, Lokman C, van den Hondel C, Punt P. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microb Cell Fact. 2003;2:1 pubmed
ISSN : 2329-5139