Срок годности/правила хранения антител
  1. Mary Johnson Ph. D.
    mary at labome dot com
    Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Перевод
  1. Константин Якимчук Ph. D.
    Konstantin dot Yakimchuk at ki dot se
    Каролинский институт, Швеция
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.ru.2.120
Дата
последнего обновления : 2013-11-07; оригинальная версия : 2012-10-12
Цитировать как
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2012;2:120

Срок годности антител при хранении может колебаться от нескольких недель до нескольких лет и зависит от внутренней природы антител и условий хранения. Оптимальные условия для хранения являются уникальными для каждого антитела, тем не менее, некоторые общие принципы могут быть применены. Антитела должны храниться в соответствующем диапазоне температур и рН, и часто, в присутствии таких концентрированных (~ 1 М) веществ, как глицерин или сахароза, с тем чтобы сохранить активность и предотвратить агрегации. Таблица 1 суммирует обычные условия хранения и другие характеристики.

aqueous, 4°C25-50% глицерол или этиленгликоль, -20°Cзамороженные при -20 - -80°C или в жидком азотеЛиофилизированные
срок хранения1 месяц1 годyearsyears
белки-носители для разведенияБСАБСАБСАнет
антиоксидантыобычно; 2-ME, DTT*обычно; 2-ME, DTT*нетнет
значение рН7.2-7.67.2-7.6нетнет
многократное использование одного образцададанет, повторное замораживание/размораживание вызывает деградацию антителНе применяется
Таблица 1. Условия хранения антител. * Метионин также может использоваться.
Условия хранения
Лабораторное оборудование
Холодильники

При хранении антител при температуре ниже нуля, важно не использовать безморозильные холодильники. Обычные бытовые холодильники являются безморозильными, и они проходят циклы свободного оттаивания несколько раз для предотвращения образования инея.

Хранение флаконов

Конъюгированные антитела следует хранить в темного цвета флаконах или во флаконах покрытых алюминиевой фольгой.

Температура

Химические модификации, такие как окисление и протеолитическая деградация белков происходят при умеренной температуре, однако степень этих реакций является гораздо более выраженной при высокой температуре. Антитела, как правило, хранятся при ≤ 4°C в чистой и стерильной стеклянной посуде или полипропиленовых флаконах. Хранение при комнатной температуре часто приводит к деградации антител и/или инактивации, обычно в результате роста микроорганизмов. Для короткого срока хранения (от 1 дня до нескольких недель), растворы антител можно хранить при температуре 4°C без значительной потери активности.

Криопротекторы: глицерин и этиленгликоль

Образование кристаллов льда может разрушить структуру белка, и таким образом, вызвать потерю эффективности антител. Криопротекторы, такие как глицерин и этиленгликоль, способны предотвратить образование водородных связей между молекулами воды и тем самым уменьшить замерзание при добавлении к водному раствору. Фактическая температура замерзания зависит от состава/концентрации криопротекторов, см. таблицу 2.

102030405060708090100
глицерол-2-5-10-16-22-34-38-19-217
этиленгиколь-4-7-15-23-34-48-51-45-29-12
Таблица 2. Точки замерзания глицерина и этиленгликоля (в градусах Цельсия) при различных концентрациях (в процентах%) в воде.

Примечание: этиленгликоль является токсичным и должен использоваться с осторожностью.

Если температура хранения ниже точки замерзания для раствора антител с криопротекторами, раствор будет затвердевать. Однако вместо образования кристаллов льда, может происходить витрификация, как в случае криоконсервации клеток/эмбрионов с ДМСО. В процессе витрификации стеклования, структурная целостность антител сохраняется.

Для повышения стабильности, глицерин или этиленгликоль добавляют до конечной концентрации 50% и антитела можно хранить при -20°C. Раствор антител следует хранить в небольших объёмах, чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания.

Важно использовать стерильный глицерин, так как глицерин может быть загрязнён микробами.

Срок годности/правила хранения антител Figure 1
Figure 1. Азид натрия при различных концентрациях ингибирует рост грамотрицательных бактерий. Из [2].
Стерилизация и антимикробные соединения

Препараты антител всегда должны быть стерилизованы фильтрованием с использованием 0,45-микронного фильтра и должны быть обработаны в асептических условиях для предотвращения микробного загрязнения.

Антимикробные агенты, такие как азид натрия (NaN3) в конечной концентрации 0,02-0,05 % (вес/объем) или тимеросал в конечной концентрации 0,01% (вес/объем) ингибируют микробный рост.

Азид натрия (NaN3) является токсичным для большинства клеток и организмов, включая человека (см. рисунок 1) [1]. Тем не менее, грамположительные бактерии (стрептококки, пневмококки, лактобациллы) устойчивы к азиду натрия см. рисунок 2) [2] [3] [4]. Азид натрия ингибирует цитохром оксидазу в митохондриальной цепи переноса электронов и вызывает, например, апоптоз в RGC-5 клетках [5]. Антитела в растворе азида натрия не должны быть использованы непосредственно в живых клетках или в исследованиях in vivo. Кроме того, азид натрия препятствует большинству реакций сопряжения. Азид натрия может быть удалён посредством гель-фильтрации или диализа.

Примечание: азид натрия был использован в подушках безопасности автомобилей старшего поколения выпуска.

Срок годности/правила хранения антител Figure 2
Figure 2. Азид натрия не может ингибировать рост грамм-положительных бактерий. Из [2].
Ингибиторы протеазы

Ингибиторы протеазы предотвращают протеолитическое расщепление белков. Протеолиз антител может стать важным вопросом для хранения препаратов асцитной жидкости и сывороток, так как и асцитные и сывороточные препараты содержат протеазы. Холодный способ хранения и/или ингибиторы протеазы могут быть использованы для устранения этой деградации.

Концентрация антител

Антитела в растворах (<1 мг/мл), более склонны к инактивации и физическим потерям в результате низкого уровня связывания с поверхностью емкости. Таким образом, желательно сохранять концентрацию антител как можно выше (например, >1 мг/мл) при хранении.

Несущий белок или белок-наполнитель, такой как очищенный бычий сывороточный альбумин (БСА) или желатин, могут быть добавлены для разбавления антител до конечной концентрации белка 1-5 мг/мл (0,1-0,5%).

Сухой лед при хранении и транспортировке

Недавние исследование показывает, что сухой лед во время хранения и транспортировки белка может вызвать ацидификацию раствора для хранения, и будет вызывать агрегацию белков (с образованием осадка), особенно с ацидными белками (белки с pI менее 7) [6]. Поликлональные IgG имеют тенденцию быть ацидными, с pI в диапазоне 4.7-7.5 [7]. Закупоренные газом флаконы и/или запечатанные газом пластиковые мешки (для расфасовки флаконов) должны быть использованы для минимизации повреждения в дополнение к повторно эквилибрации образцов при -80°C в морозильнике в течение нескольких дней. Пакеты Dri-Shield Moisture Barrier Bags от 3М, продукция Thermo Scientific™ Nunc™ Cryoflex и пакеты IMPAK, такие как 0203PM56OZETN и 05MP081OZE, могут быть полезны.

Антиоксиданты

Эффект окисления молекул антител был тщательно изучен, особенно для терапевтических антител. Остатки метионина в структурной цепи антитела, как правило, являются основным сайтом окисления, когда антитела подвергаются воздействию интенсивного света и/или при повышенной температуре [8]. Антитела содержат как внутри- так и междуцепочечную дисульфидные связи. Обычно используемые антиоксиданты, такие как 2-МЕ и DTT, не могут предотвратить дисульфидные перегруппировки [9], в то время как другой антиоксидант - метионин не способствует перестройке дисульфидных групп и может быть лучшим антиоксидантом для хранения антител [Все Fitchmun, Somatek, Сан-Диего, Калифорния, США].

Поликлональные антителa

Активность почти не теряется, если сыворотку непосредственно хранить в течение десяти лет при -20°C. Однако, после очистки антител, некоторая потеря активности была замечена в течение многих лет, хотя и очень медленно. Представляется также, что глицерин не является необходимым для хранения при -20°C в течение многих лет или даже десятилетий, если антитела не подвергаются повторным циклам замораживания/размораживания. Антитела следует хранить в высокой концентрации.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела можно хранить при -20°C в 50% глицерине. Сообщается также, что моноклональные антитела могут быть сохранены под насыщенным сульфатом аммония в виде гранул при 4°C или -20°C в течение многих лет без потери активности, бактериального роста или окисления.Лиофилизация (высушивание вымораживанием или высушивание из замороженного состояния) обеспечивает альтернативный способ стабилизации антител, которые не устойчивы к замораживанию. В большинстве случаев, лиофилизированные белки можно хранить при -20°C. Лиофилизация требует дорогостоящего оборудования и является трудоемким.

Конъюгированные антитела

Антитела следует хранить в затемнённых или покрытых алюминиевой фольгой контейнерах.

Фермент-конъюгированные антитела

Щелочная фосфатаза и других конъюгированные ферменты особенно чувствительны к замораживанию, и в целом их следует хранить при температуре 4°C после конъюгирования на короткий срок.Конъюгаты антител лучше всего хранить в течение длительного срока при -20°C с глицерином или этиленгликолем при конечной концентрации 50%. Хотя некоторые конъюгаты ферментов могут храниться при температуре -20°C без криопротекторов, замороженные образцы должны быть предназначены для единичного использования для предотвращения повторяющихся циклов замораживания-размораживания.

Флуоресцеин- конъюгированные антитела

Флуоресценция может снижаться при воздействии света. Как и любые реагенты конъюгированные с флуоресцентными метками (а не только антитела), конъюгаты антитела должны быть защищены от света. Флуорофорконъюгированные антитела следует хранить при температуре 4°C и никогда не замороживать.

Ссылки
  1. Chang S, Lamm S. Human health effects of sodium azide exposure: a literature review and analysis. Int J Toxicol. 2003;22:175-86 PMID 12851150
  2. Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. J Bacteriol. 1944;47:221-30 PMID 16560767
  3. Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: II. The Action of Sodium Azide on Bacterial Catalase. J Bacteriol. 1944;47:231-8 PMID 16560768
  4. Lichstein H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: III. The Effect of Sodium Azide on the Gas Metabolism of B. subtilis and P. aeruginosa and the Influence of Pyocyanine on the Gas Exchange of a Pyocyanine-Free Strain of P. aerugino. J Bacteriol. 1944;47:239-51 PMID 16560769
  5. Ji D, Kamalden T, del Olmo-Aguado S, Osborne N. Light- and sodium azide-induced death of RGC-5 cells in culture occurs via different mechanisms. Apoptosis. 2011;16:425-37 PMID 21279443 CrossRef
  6. Murphy B, Swarts S, Mueller B, van der Geer P, Manning M, Fitchmun M. Protein instability following transport or storage on dry ice. Nat Methods. 2013;10:278-9 PMID 23538862 CrossRef
  7. Szenczi A, Kardos J, Medgyesi G, Zavodszky P. The effect of solvent environment on the conformation and stability of human polyclonal IgG in solution. Biologicals. 2006;34:5-14 PMID 16168667
  8. Lam X, Yang J, Cleland J. Antioxidants for prevention of methionine oxidation in recombinant monoclonal antibody HER2. J Pharm Sci. 1997;86:1250-5 PMID 9383735
  9. Liu Y, Chen X, Enk J, Plant M, Dillon T, Flynn G. Human IgG2 antibody disulfide rearrangement in vivo. J Biol Chem. 2008;283:29266-72 PMID 18713741 CrossRef
ISSN : 2329-5139