Применение антител
Jennifer Oliver (jaoliver313 at gmail dot com)
Wayne State University, United States
Перевод
Алексей Степаненко (a dot a dot stepanenko at gmail dot com)
Институт молекулярной биологии и генетики
DOI
//dx.doi.org/10.13070/mm.ru.3.182
Дата
последнего обновления : 2016-10-31; оригинальная версия : 2013-03-31
Цитировать как
MATER METHODS ru 2013;3:182
Абстракт

Обзор применения антител в биомедицинских исследованиях.

English Abstract

An overview of antibody applications in biomedical research. Application keys used in Labome searches and webpages are explained.

ПрименениеДеталиАббревиатуры в Labome
Вестерн блот тип геля: восстанавливающий, нативный
тип лизата: клеточный лизат, лизат ткани, лизат иммуноген-гиперэкспрессирующего образца
WB
Вестерн одной клетки scWB
зондируемое изоэлектрическое фокусированиеPIF
иммуногистохимияфиксация: ацетон, этанол, формалин/формальдегид/параформальдегид, метанол, микроволновая печь, нагревание
заливка: акрил/пластик, смотрите ниже
IH
заливка: парафинIHC-P
заливка: замороженныйIHC-F
свободно плавающие срезы IHC-Free
иммуноцитохимия IC
анализ проксимального лигированияPLA
в клетке Вестерн ICW
проточная цитометрия FC
сортировка клеток FACS
иммунопреципитация IP
иммунопреципитация хроматина ChIP
секвенирование иммунопреципитированного хроматина ChIP-Seq
РНК иммунопреципитацияRIP
сшивающая иммунопреципитацияCLIP
иммуноанализ
ELISA ELISA
радиоиммуноанализRIA
иммуноферментный анализ EIA
иммуно-ПЦРI-PCR
функциональный анализ
активация A
блокировка/нейтрализацияNeut
анализ сдвига электрофоретической подвижности EMSA
Масс-спектрометрияMS
стабильные изотопные стандарты и захват анти-пептидных антителSISCAPA
Иммуно-MRMI-MRM
Иммуно-MALDIiMALDI
масс-спектрометрический иммунологический анализMSIA
Таблица 1. Основные методы, в которых применяются антитела, и их аббревиатура в Labome.

В медико-биологических исследованиях антитела являются важнейшими реагентами. Антитела высокочувствительны и высоко специфичны для конкретного эпитопа, что делает их идеальными реагентами для исследовательских применений. Кроме того, современная биотехнология способствовала крупномасштабному производству антител. В 1890-х годах антитела были впервые описаны фон Берингом и Китасато, которые определили, что неактивные токсины вызывали защитные иммунные реакции против активных токсинов в организме животных, и что инъекции сыворотки из этих защищенных животных могут передавать защиту другим животным. По этой причине антитела были первоначально описаны как «антитоксины»; однако, как позже выяснилось, антитела имеют гораздо более широкий репертуар распознавания антигенов [1].

По-простому, антитело является растворимой формой рецептора антигена В-лимфоцитов. Антитела продуцируются исключительно зрелыми лимфоцитами. У мышей и людей существуют пять изотипов антител, отличающиеся по структуре иммуноглобулина, и состоят из 2 тяжелых цепей и 2 легких цепей. Эти цепи связаны между собой дисульфидными связями, которые обеспечивают уровень гибкости целой молекуле. Часть молекулы без легких цепей известна как постоянная или Fc (кристализируемый фрагмент) область; эта область определяется фиксированным набором генов и является одинаковой для всех антител конкретного изотипа вида. Часть, которая включает в себя связанные тяжелые и легкие цепи, называется переменной или Fab (антиген-связывающий фрагмент) областью; крайние концы этой области содержат гипервариабельные участки, которые распознают и связываются с эпитопом антигена-мишени. Fab-область также определяется фиксированным набором генов, но дальнейшие соматические мутации необходимы для создания уникальных и весьма специфических гипервариабельных сайтов (Рисунок 1) [1, 2].

Применение антител  Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение молекулярной структуры антитела. Красные полоски указывают на дисульфидные связи, которые связывают тяжелые цепи друг с другом и с легкими цепями.

В настоящее время антитела получают в животных или животных клетках. Как моноклональные (гомогенный изотип и антигенная специфичность), так и поликлональные (гетерогенный изотип и антигенная специфичность) антитела можно получить у поставщиков отрасли и в отдельных лабораториях. Поликлональные антитела выделяют из сыворотки животных, которые были иммунизированы антигеном-мишенью. В то время как поликлональные антитела часто специфичны для антигена, они содержат смесь различных антител против различных эпитопов одного и того же антигена, а также могут содержать антитела против неродственных белков, которые могут повлиять на результаты тестирования. Кроме того, поликлональные антитела зависят от источника-животного, и, таким образом, 2 фасовки поликлональных антител против конкретного антигена не будут одинаковыми. В противоположность этому моноклональные антитела получают из гибридом, которые представляют собой иммортализованные клонированные клеточные линии, сгенерированные слитием В-лимфоцитов из иммунизированных мышей с клетками миеломы мыши или нескольких других видов. Эти клетки могут непрерывно производить однородные антитела и в настоящее время являются стандартом для технологии производства антител.

методколичество публикаций
вестерн блот57139
иммуногистохимия41630
проточная цитометрия24872
иммуноцитометрия17825
иммунопреципиация4939
ChIP/ChIP-сек3238
блокирование или активация2847
ELISA2832
EMSA479
Таблица 2. Число публикаций со ссылкой на конкретное применение антител среди 38430 публикаций, проанализированных Labome.
Детекция и изоляция белка
Иммунопреципитация

В анализах иммунопреципитации (IP), также известные как "тянуть вниз" анализы, антитела используются для прикрепления и осаждения антигенов-мишеней из клеточного лизата, биологической жидкости или другого водного раствора. Процесс осаждения облегчают различные виды шариков (например, магнитные, агарозные, сефарозные), которые связываются с Fc-областью антитела, и затем позволяют комплексам антитело-антиген отделиться от общего лизата с помощью центрифугирования или другим механическим способом (Рисунок 2) [3].

IP анализы популярны во многих клеточных и молекулярных биологических исследованиях. На самом базовом уровне IP может быть использовано для очистки антигена-мишени для дальнейшего использования в исследованиях. IP также часто используется для определения взаимодействия между несколькими белками в гомеостатических клетках или в клетках, которые были подвергнуты определенной обработке. В таких анализах антитело против первого белка используется для осаждения, и последующий анализ, такой как вестерн-блоттинг (см. ниже) используется, чтобы определить, был ли осажден второй белок с первым.

Применение антител  Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое изображение процедуры стандартной иммунопреципитации. Перепечатано с разрешения Pierce Protein Biology Products, Thermo Scientific.
Иммуносорбентный анализ

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISAs) используется для качественного и количественного анализа присутствия или концентрации определенного растворимого антигена, такого как специфическое антитело или пептид в жидких пробах (биологические жидкости и надосадочные жидкости клеточной культуры). Эти анализы используют способность полистирольных планшетов связывать белки, включая антитела, а также особенности антител для антигенов-мишеней. Как правило, эти анализы включают колориметрическую конечную точку, которая может быть обнаружена с помощью оптической плотности при определенной длине волны и количественно просчитана из известной стандартной кривой разведений антигена или антитела. Есть 3 часто используемых формата ELISA.

Применение антител  Рисунок 3
Рисунок 3. Схематическое изображение процедуры стандартной процедуры прямой ELISA по типу сэндвича.
Прямые ELISAs

Прямые ELISAs используют известное количество моноклональных антител для определения концентрации конкретного антигена в растворе. Например, прямой ELISA можно определить концентрацию конкретного цитокина, секретируемого популяцией клеток после стимуляции или ингибирования, путем измерения количества этого цитокина в супернатанте культуры. Прямые ELISAs часто выполняются в соответствии с методом «сэндвича», в котором антиген-мишень зажата между двумя моноклональными антителами, которые связываются с различными эпитопами того же антигена. «Захватывающее» антитело используется для покрытия лунок планшета для анализа. После промывки и блокировки раствор, который должен быть проанализирован, добавляют в лунки, чтобы специфический антиген, если он присутствует, был "захвачен". После того, как избыток вымывается, то «детектирующее» антитело, которое часто связано с биотином, добавляют в лунки. Затем добавляется стрептавидин-ферментный комплекс, который связывается с биотин-сшитым детектирующим антителом. И, наконец, добавляется в лунки колориметрический субстрат для фермента. Относительное количество может быть определено с помощью простых изменений цвета в лунки при анализе: чем больше изменение цвета, тем выше концентрация антигена в образце. Абсолютное количество может быть определено с помощью стандартной кривой, которая генерируется из лунок с известной концентрацией антигена-мишени. Этот процесс также может быть выполнен без иммобилизованного антитела; другими словами, антиген может быть нанесен непосредственно на лунки. Тем не менее, метод сэндвича более специфичен из-за использования системы двойного антитела [4] (Рисунок 3).

Применение антител  Рисунок 4
Рисунок 4. Схематическое изображение процедуры конкурирующей ингибирующей ELISA.
Непрямые ELISAs

Непрямые ELISAs используются для измерения количества антиген-специфического антитела в растворе. В этом анализе специфический антиген связан непосредственно с лункой планшета для анализа. Раствор, который может содержать антитело (например, сыворотка крови, гибридомная культуральная среда) затем добавляется в лунки, чтобы произошло связывание антитело-антиген. Далее связанные с ферментом специфические вторичные антитела к Fc-области неизвестного антитела добавляют в лунки, где они прикрепляются к антителам, которые связываются с антигеном на планшете. И, наконец, добавляют колориметрический субстрат, который расщепляется и изменяется связанным ферментом, а наличие тестируемого антитела определяется оптической плотностью.

Конкурентные ELISAs

Конкурентные ELISAs часто используются для обнаружения малых антигенов. В этих анализах образцы с неизвестными концентрациями антигена-мишени добавляют в лунки, которые были покрыты известными концентрациями одного и того же антигена-мишени. Затем добавляют в лунки меченые детектирующие антитела против антигена-мишени. Растворимые комплексы антиген-антитело затем вымываются и определяется количество антитела, связанного с антигеном планшета [5]. Выходной сигнал конкурентных ELISAs противоположный тому, что для других ELISAs. В частности, чем ниже сигнал, тем выше концентрация антигена в образце, так как свободный антиген ингибирует связывание антитела с антигеном, нанесенном на планшет (Рисунок 4) [4].

Применение антител  Рисунок 5
Рисунок 5. ELISPOT. A, схема процедуры. B, репрезентативные изоражения ELISPOT лунок. Спленоциты от вакцинированной мыши стимулировали антигеном-мишенью в течение 48 часов; клетки удаляли, и лунки затем окрашивали детектирующим антителом и колориметрическим реагентом.
ELISPOT анализы

ELISPOTs похожи на сэндвич ELISAs в том, что детектируемые цитокины или другие растворимые факторы захватываются моноклональными антителами, которые связаны с аналитическим планшетом, и детектируются вторым моноклональным антителом, связанным с молекулой, которая позволяет провести колориметрическую оценку. Тем не менее, в ELISPOT анализах цитокин-продуцирующие клетки культивируют непосредственно в покрытых захватывающими антителами и блокированных планшетах, которые покрыты белком-связывающей мембраной, позволяющей захват цитокинов из отдельных клеток и их локализацию в одном месте. Клетки выбрасываются после определенного периода времени культивирования, а остальная часть анализа выполняется образом, очень похожим на анализ ELISA. Однако, окончательный колориметрический шаг анализируется с помощью визуального обнаружения под микроскопом или с помощью специализированного ридера. Успешный ELISPOT анализ цитокин-продуцирующих клеток будет приводить к большому числу различных цветных пятен в каждой лунке, и каждая точка должна соответствовать одной ячейке. ELISPOT анализы особенно полезны для обнаружения ответов очень небольших популяций клеток, таких как антиген-специфических Т-клеток из вакцинированной мыши, которые не могут быть легко обнаружены с помощью других видов анализа (рисунок 5).

Иммуносорбентные технологии также могут быть использованы в сочетании с технологией микрочипов для получения высокой пропускной способности функциональных протеомических анализов. В этих анализах стеклянные или полистироловые слайды покрыты либо захватывающими антителами, либо образцом (например, клеточным лизатом). Первый похож на классический сэндвич ELISA или ELISPOT, поскольку антиген связан с антителами, связанными с планшетом, и свободными антителами, а второй похож на прямой ELISA, так как антиген-мишень непосредственно связан с планшетом. Детектирующие антитела для обоих вариантов являются специфическими для известных антигенов и флуоресцентно помечены. Эта технология может относительно быстро скрининровать изменения в концентрации белка и статусе его активации [6, 7].

Применение антител  Рисунок 6
Рисунок 6. Вестерн блоттинг. A, схема процедуры. B, репрезентативные изображения. CD8 + T-клетки стимулировали сшитыми антителами против рецептора Т-клеток и костимуляторного CD28 рецептора в течение указанных промежутков времени перед тем, как лизировать и провести вестерн-блоттинг с указанными антителами
Иммуно-ПЦР

Иммуно-ПЦР (И-ПЦР) представляет собой метод, который сочетает в себе чувствительность амплификации нуклеиновой кислоты с помощью ПЦР со специфичностью анализов, основанных на антителах, что приводит к увеличению чувствительности детектирования. Как правило, можно получить увеличение чувствительности детекции в 100-10000 раз по сравнению с пределом обнаружения ИФА. И-ПЦР была впервые описан Сано и соавт. в 1992 году [8]. Несмотря на потенциал этой техники, в течение нескольких лет использование И-ПЦР в диагностических и биомедицинских целях было ограничено некоторыми проблемами, включая продолжительность анализа и, как следствие, увеличение частоты ошибок. Кроме того, одним из главных недостатков была трудность в связывании антитела с олигонуклеотидами. Некоторые решения были предложены для быстрых и эффективных методов конъюгации (например, Thunder-Link® антитело-олигонуклеотид система конъюгирования Innova Biosciences). Кроме того, введение мультиплексных с высокой пропускной способностью методов в значительной степени улучшили И-ПЦР, которая в настоящее время обычно используется в качестве диагностического теста для некоторых бактериальных и вирусных патогенов, а также для выявления опухолевых маркеров и загрязнения пищевых продуктов [9]. Сочетание количественного ПЦР с И-ПЦР (КИ-ПЦР) позволило количественно оценить биомаркеры в сложных биологических образцах, которые трудно обнаружить с помощью классического иммуноанализа [10].

Блоттинг белков
Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг является методом, в котором электрофоретически разделенные белки в геле переносят на мембрану с помощью электрического заряда, после чего белки могут быть детектированы с помощью меченых специфических антител.

Натрий додецилсульфат электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) используется для детекции белков, которые были химически денатурированы с помощью SDS. Однако, некоторые специфические антитела не распознают целевой эпитоп денатурированных белков. В током случае может быть приготовлен нативный полиакриамидный гель в отсутствии SDS [11].

Блот может быть выполнен влажным, полусухим или сухим способом. В мокром подходе гель с мембраной зажат различными фильтрами и погружен в резервуар, заполненный определенным буфером, таким как трис-глицин. В полусухом методе, сэндвич-гель смачивают только небольшим количеством буфера и заключают непосредственно между электродными пластинами. И, наконец, в сухой системе никакого буфера не требуется, и используются предварительно смонтированные готовые к использованию стеки, содержащие электроды, буфер и мембрану. Хотя сухой способ быстрее, мокрый способ обеспечивает более стабильные результаты и требует меньшего устранения проблем, тогда как полусухой метод требует тщательной подгонки всех компонентов сэндвича [11]. Кроме того, небольшие белки могут проскочить через мембрану в полусухих переносах, которые могут протекать слишком долго [12].

После переноса и блокировки для уменьшения связывания неспецифических белков мембраны инкубируют с первичными антителами, специфичными для белка, представляющего интерес. Моноклональные антитела, как правило, имеют более высокую специфичность. Тем не менее, многие из этих антител генерируются против пептидного фрагмента, а не нативного белка и, таким образом, не могут быть эффективными в обнаружении белков, разделенных в нативном PAGE. Поликлональные антитела могут быть также использованы, но могут дать более высокие значения фона. Так как первичные антитела часто немечены, меченые вторичные антитела, которое являются видо-специфичными для участка Fc первичного антитела, используются на этапе обнаружения. Чаще всего вторичное антитело помечено с помощью фермента. Фермент-меченые блоты можно визуализировать инкубированием блота в хемилюминесцентном субстрате для фермента с последующим воздействием на авторадиографическую пленку. Положительно меченые белки будут видны как темные полосы на пленке (Рисунок 6).

Дот-блот

Дот-блот похож на вестерн-блоттинг в том, что белки детектируются на мембране; однако, для дот блотов белки не разделяются электрофорезом. Вместо этого белок-содержащий образец наносят непосредственно на мембрану. Этот метод не является количественным, но он может быть полезным для обнаружения присутствия или отсутствия конкретных белков; например, дот блоттинг может использоваться для обнаружения местоположения определенных белков в клеточном лизате, разделенном в градиенте сахарозы [13].

Применение антител  Рисунок 7
Рисунок 7. Зондированное изоэлектрическое фокусирование (PIF). Схема процедуры. Из [14], права принадлежат PNAS.
Зондированное изоэлектрическое фокусирование (PIF)

Белки в очень небольшом количестве (из 25 клеток [14] ) разделяются с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования и иммобилизируются в капилляре, а затем детектируются с помощью первичных антител и хемилюминесценции [14] (рис 7).

Вестерн блоттинг одной клетки

В статье, опубликованной Hughes и др. в журнале Nature Methods, описан новый и быстрый метод иммуноблоттинга для анализа белков [15]. Одноклеточный вестерн блоттинг метод включает в себя аспекты как и микрочипов, так и струйной техники. Авторы описывают производство слайдов, покрытых полиакриламидным гелем, в котором формируют микролунки, таким образом, позволяя клеткам из суспензии заполнить лунки со средней плотностью приблизительно 1 клетка/лунку. После этого клетки в лунках лизируют и подвергают электрофорезу. Разделенные белки затем сшивали с гелем (шаг, который дает превосходную стабильность, о чем свидетельствует повторный стрипинг и reprobing геля), окрашивали первичными и меченными флуорохромом вторичными антителами, таким образом, следуя процедуре традиционного вестерн-блоттинга, и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Несмотря на то, что это первый доклад данного метода и такие вопросы, как диффузия клеточных лизатов из лунок и последующие потери белка, остаются все еще нерешенными, этот метод представляет собой важный шаг в анализе белка по следующим причинам. Во-первых, одноклеточный или около одноклеточный характер анализа позволяет избегать маскирования межклеточной вариабельности в пределах макроскопически гомогенной популяции клеток. Во-вторых, вестерн-блоттинг одной клетки обладает высокой чувствительностью и специфичностью, в особенности в отношении офтаргетного связывания антитела, что не может быть достигнуто с помощью других методов анализа белков в одиночных клетках, таких как проточная цитометрия или ICC. В-третьих, этот метод обеспечивает преимущества для образцов в очень малом количестве. После оптимизации этот подход позволит применение его в функциональных или морфологических экспериментах, которые, как правило, анализируются с помощью обычного вестерн-блоттинга или скрининга с высокой пропускной способностью.

Применение антител  Рисунок 8
Рисунок 8. Схематическое изображение процедуры хроматиновой иммунопреципитации.
Определение взаимодействия между нуклеиновой кислотой и белком
Иммунопреципитация хроматина
Хроматин IP (ChIP)

ChIP первоначально была разработана в 1980-е годы, чтобы оценить взаимодействия РНК-полимеразы II с генами-мишенями [16]. В этой процедуре клетки фиксировали в формалине, или подобным фиксирующим средством сшивали клеточную ДНК и любые связанные с ней белки. Фиксированные клетки далее обрабатывают ультразвуком, чтобы фрагментировать ДНК-белковые комплексы на фрагменты 100-300 п.о. (пар оснований), и фрагменты затем иммунопреципитируют в соответствии со стандартными методами с антителом, специфичным для белка, представляющего интерес, таким как гистоны или фактор транскрипции. На конечной стадии ДНК-белковые комплексы диссоциируют разрушением сшивок, а связанные фрагменты ДНК идентифицируют с помощью ПЦР-анализа. В то же время белки, осажденные вместе с ДНК, могут быть идентифицированы с помощью подходов, основанных на масс-спектрометрии [17]. Стандартный метод ChIP используется для подтверждения возможной связи между белком и геном-мишенью (Рисунок 8) [18].

Одним из ограничений ChIP является возможность того, что стадия сшивания может изменить антиген-мишень, и, таким образом, нарушить связывание антитела и процедуру IP. В таких случаях ChIP может быть проведена без стадии сшивания; эта процедура известна как IP нативного хроматина или N-ChIP [16, 19]. Хотя устранение сшивания может улучшить распознавание антигена, это, как правило, только полезно в том случае, если известно, что целевой белок сильно связывается с ДНК.

ChIP-на-Chip

Совсем недавно ChIP была модифицирована для использования в анализах с высокой пропускной способностью. Например, ChIP -на-ChIP сочетает в себе технику ChIP с технологией микрочипа для обеспечения скрининга флуоресцентно меченых последовательностей целого генома. В этих анализах осажденную ДНК и контрольную (обычно непреципитированный образец) ДНК метят различными флюорохромами и гибридизуют с ДНК-микрочипом конкретного локуса или даже целых небольших геномных олигов. Микрочип можно анализировать с помощью стандартных методов, чтобы предоставить подробную информацию о связывающем сайте для ChIP образца относительно контрольной ДНК.

ChIP-seq

ChIP-seq сочетает в себе ChIP с современной технологией секвенирования с высокой пропускной способностью для облегчения идентификации ранее неизвестных генов-мишеней. Так как секвенирование следующего поколения (NGS) может обеспечить высокое разрешение анализа больших количеств геномного материала, ChIP-seq является методом, подходящим для ChIP анализа целых геномов [20].

CLIP

Сшивающая иммунопреципитация (CLIP) впервые разработана Ule и др. в 2003 году в исследовании взаимодействий между фактором сплайсинга NOVA и нейрон-специфическим РНК-связывающим белком (RBP) [21]. Он подобен ChIP, но есть несколько существенных отличий. В CLIP предложенным сшивающим агентом является УФ-облучение. Ультразвук не требуется из-за более короткой длины РНК-транскриптов, и клетки могут быть лизированы в стандартном буфере. Тем не менее, все лизаты должны быть обработаны РНКазой для защиты интересующих транскриптов. В 2008 году CLIP был скомбинирован с секвенированием с высокой пропускной способностью (HITS-CLIP), также известный как CLIP-Seq [22]. Подобно тому, как метод ChIP позволяет анализ ДНК-белковых взаимодействий, CLIP позволяет проводить анализ РНК-белковых взаимодействий в масштабе генома. HITS-CLIP, в частности, широко используется для выявления белок-РНК-сайтов взаимодействия для факторов сплайсинга, например, таких как PTB [23], FOX2 [24] и Argonaute [25]. Тем не менее, HITS-CLIP имеет некоторые недостатки, связанные с эффективностью сшивания и точного определения мест связывания РНК-связывающих белков. Для преодоления этих проблем в 2010 году Hafner и др. разработали фотоактивируемое рибонуклеозид усиленное сшивание и иммунопреципитацию (PAR-CLIP) [26] и в 2011 году Konig и др. предложили individual-nucleotide resolution CLIP (iCLIP), который дает разрешение на уровне одного нуклеотида [27].

РНК иммунопреципитация

РНК иммунопреципитация (RIP) представляет собой методологию, похожую на ChIP, в которой характеризуются взаимодействия между белками и специфическими последовательностями РНК [28]. Основные этапы включают I) обработку живых клеток формальдегидом для формирования обратимых сшивок белок-РНК; II) иммунопреципитация интересующего белка с использованием специфических антител; III) разрушение сшивок; IV) анализ ассоциированных РНК с помощью RT-PCR. RIP может быть скомбинирован с микрочипом (RIP-чип), как впервые было описано в 2006 году [29] или NGS методом (RIP-seq), что позволяет быстрый и точный углубленный анализ РНК и РНК-связывающих белков, ключевых элементов регуляции экспрессии генов в процессе сплайсинга, редактирования, стабильности и трансляции РНК.

Электрофорезный анализ сдвига подвижности (EMSAs)

Электрофорезный анализ сдвига подвижности (EMSAs) выполняется для определения сродства ДНК-связывающих белков со специфическими участками ДНК [30]. В классическом EMSA радиоактивно меченые фрагменты ДНК интересующего сайта связывания инкубируют с целевым белком. Относительная аффинность связывания определяется "сдвигом" ДНК вверх в процессе гель-электрофореза, поскольку связанный белок увеличивает молекулярную массу связанной ДНК, и, таким образом, вызывает медленное продвижение через гель. Для повышения специфичности также могут быть добавлены антитела, специфичные для белка; дополнительное антитело будет способствовать дальнейшему замедлению миграции ДНК-белкового комплекса через гель в процессе электрофореза, что известно как EM суперсдвиг [31].

Применение антител  Рисунок 9
Рисунок 9. Схематическое изображение и репрезентативное изображение процедуры иммуногистохимии. Изображение ганглий мышечной оболочки кишечника мыши, полученное с помощью конфокальной микроскопии. Зеленый, окрашивание тирозин гидроксилазы. Синий, аутофлуоресценция. Распространено Swharden под лицензией Creative Commons
Детекция in situ

Иммуногистохимия (IHC) и иммуноцитохимия (ICC) являются двумя методами, которые обычно используются для оценки как наличия, так и расположения белков внутри тканей и клеток. Методы различаются в основном подготовкой проб; IHC осуществляется на фиксированных секциях цельной ткани, в то время как ICC проводят на клетках, которые были выделены из стромы (например, клетки крови, прикрепившиеся к слайдам с помощью центрифугирования или монослойная культура клеток, выросшая на покровном стекле) (Рисунок 9). Разновидностью иммуноцитохимии является в клетке Вестерн анализ (ICW) [32]. Во время ICW клетки, выращенные на многолуночном планшете, фиксируются и инкубируют с первичными антителами таким же образом, как в иммуноцитохимии, и связанные антитела, как правило, обнаруживают с помощью ближней инфракрасной флуоресценции конъюгированных первичных или вторичных антител (например, DyLight® 680 или 800), чтобы избежать автофлуоресценции клеток и планшетов. Сигнал от каждой лунки часто нормализуют с другим красителем в ближней инфракрасной области с различной длиной волны излучения, таким как DRAQ5 [33, 34] для сравнения. Только антитела, которые были подтверждены в иммуногистохимии (примечание: не в Вестерн блоттинге), могут быть использованы в ICW, чтобы гарантировать, что антитела и детекция являются специфичными.

Методы фиксации

Есть несколько общих методов фиксации тканей и клеток, предназначенных для IHC или ICC анализа, и выбор метода фиксации зависит от типа анализа. Образцы цельной ткани, которые будут анализироваться IHC, часто фиксируют формальдегидом, полу-обратимым сшивающим агентом, который генерируется из параформальдегида и может быть далее разбавлен до формалина. Хотя несколько работ отметили негативное воздействие формальдегида на образец из-за чрезмерной фиксации, другие доклады не подтверждают таких негативных последствий и наоборот призывают к достаточно длительной по времени фиксации формальдегидом для сшивания клеточных белков. Фиксация формальдегидом целых тканей или, в некоторых случаях, даже целых животных осуществляют путем погружения ткани в рабочий раствор формальдегида (например, 4% об/об в воде). Образование капель после фиксации формальдегидом может происходить в препаратах нейронов или сетчатке [35], и сахароза может быть добавлена в фиксирующий раствор для предотвращения их образования [35].

Спирты, в частности метанол и этанол, часто используются для фиксации клеток для ICC или для применений, в которых ДНК не должна быть повреждена. Спирты, как правило, не рекомендуется для солидных тканей, так как они, как полагают, не сохраняют морфологию тканей в той же степени, как формальдегид [36]. Кроме того, фиксация спиртом может привести к усадке ткани. Ацетон реже используется в качестве закрепителя, и рекомендуется для фиксации замороженных тканей, так как он может улучшить обнаружение эпитопов, или в качестве вторичной стадии после фиксации метанолом [37]. Тем не менее, фиксация ацетоном может также привести к усадке ткани. И, наконец, для применений, в которых сохранение антигена имеет важное значение, ткани могут быть быстро заморожены в изопентане, который был охлажден жидким азотом и хранился при -80ºC до дальнейшей обработки.

Метод Показания к применению Преимущества и недостатки
На основе формальдегидаЦелые ткани
  • Простой и недорогой
  • Повышает сохранность образцов
  • Может нарушить некоторые антигенные эпитопы (см. Извлечение эпитопов)
СпиртКлетки для иммуноцитохимического анализа
  • Не сшивает ДНК в образцах
  • Не рекомендуется для целых тканей из-за неполного сохранения морфологии тканей
  • Может привести к усадке образца
АцетонЗамороженные ткани или вторичная обработка после фиксации метанолом
  • Может обеспечить лучшую фиксацию, чем быстрое замораживание само по себе
  • Может привести к усадке образца
Быстрое замораживаниеСохранение антигенных эпитопов
  • Быстро сохраняет эпитопы антигенов
  • Необходимо хранить в замороженном состоянии, чтобы сохранить ткани, которые испытывают проблемы с долгосрочным хранением
Таблица 3. Методы фиксации в иммуногистохимии и иммуноцитохимии.
Методы встраивания

До секционирования и окрашивания ткани должны быть встроены в субстрат. Парафин часто используется для встраивания секций цельной ткани. Поскольку парафин является гидрофобным, ткани должны быть сначала обезвожены через серию инкубаций в градуированных и возрастающих концентрациях этанола. Предпоследний шаг перед парафиновой перфузией является инкубирование в ксилоле полностью обезвоженной ткани. После того, как ткань была перфузирована парафином в течение короткого промежутка времени, она может быть размещена (как правило, в пределах пластиковой кассеты) в парафиновой 65% ванне, а затем в пресс-форме, чтобы затвердеть в виде небольших блоков, которые могут быть нарезаны на микротоме. Встраивание в парафин популярно благодаря своей относительной легкости, низкой стоимости, длительного срока сохранности и доступности. Тем не менее, парафин имеет свои недостатки, не в последнюю очередь из которых является невозможность вырезать очень тонкие (<5 мкм) секции. Для получения высокой разрешающей способности световой микроскопии и электронной микроскопии, помещение в пластик может быть лучшим выбором, так как позволяет нарезку очень тонких срезов и может помочь сохранить форму ткани. Кроме того, пластик может обеспечить более успешное секционирование очень твердых тканей, таких как кости. Тем не менее, пластик менее широко доступен и дороже, чем парафин, и может помешать некоторым протоколам окрашивания. Ткани, которые были предварительно быстро заморожены, могут быть встроены в соединение с оптимальной температурой нарезания (OCT), которое представляет собой раствор водорастворимых гликолей и смол. OCT оставляет очень мало остатков и, таким образом, обеспечивает низкий фоновый сигнал и идеально подходит для иммунокрашивания замороженных тканей. Одним существенным недостатком OCT - это его непрозрачность при замораживании, которая представляет трудность в отношении правильного положения замороженных тканей для секционирования.

Метод Показания к применению Преимущества и недостатки
ПарафинТкани, фиксированные формальдегидом
  • Простая и доступная технология
  • Хорошее длительное хранение блоков парафиновых тканей
  • Мягкая среда может не позволить провести тонкое секционирование
  • Необходимая фиксация может привести к повреждению эпитопов.
ПластикОчень твердые фиксированные ткани или ткани, которые должны быть срезаны очень тонко (например, образцы для электронной микроскопии)
  • Жесткость среды позволяет нарезку очень тонких (~ 1 μm) секций или твердых тканей (например, кости)
  • Более дорогой
  • Может влиять на некоторые протоколы окрашивания
Optimal Cutting Temperature medium (OCT)Быстро замороженные ткани
  • Низкий фоновый сигнал
  • Непрозрачность приводит к затруднению в правильном положении тканей для секционирования.
Таблица 4. Методы встраивания тканей в иммуногистохимии.
Извлечение эпитопов

Хотя фиксация формалином имеет много преимуществ, она может нарушить 3-мерные структуры эпитопов антигена. Тепло-индуцированная экспозиция эпитопов (HIER) может быть использована для образцов на слайдах, чтобы обратить вспять этот процесс. Используют как тепло, так и кислотный или щелочной раствор; традиционно, слайды нагревают в буфере цитрата натрия с рН 6, хотя буферы с высоким рН являются более эффективными для извлечения некоторых антигенов. Слайды и буфер могут быть нагреты в ванне очень горячей водой, скороварке или автоклаве, или микроволновой печи в зависимости от имеющегося оборудования. Процесс высвобождения эпитопов был подробно изучен масс-спектрометрией MALDI-TOF, и формальдегидные поглотители были признаны новыми антиген-экспонирующими агентами [38].

Маркировка/детекция

Смонтированные образцы можно окрашивать несколькими способами. Обычно используется колометрическое окрашивание энзим-связанными антителами и колориметрическими субстратами. Этот метод является относительно простым, колориметрические реакции, как правило, стабильны, и предметные стекла могут быть проанализированы с помощью стандартной микроскопии. Тем не менее, эндогенная ферментативная активность или неспецифическое связывание стрептавидин-меченых реагентов с эндогенными биотинами может повысить фоновый сигнал, и, как правило, только 1 или 2 антигена могут быть проанализированы в одном образце. В связи с этим иммунофлуоресценция или использование флуорохромом меченых антител является предпочтительным, так как позволяет одновременно маркировать и обнаруживать нескольких антигенов. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать фотообесцвечивание связанных флюорохромов, что часто необратимо.

Золото-связанное иммунное окрашивание (иммунозолотое мечение) полезно для анализов с высоким разрешением. Образцы могут быть инкубированы с антителами, которые связаны с частицами золота различных размеров, что позволяет обнаруживать различные антигены в одном образце. Эти частицы могут быть обнаружены с высокой чувствительностью и высоким разрешением в электронном сканирующем микроскопе, что позволяет очень точную локализацию антигенов-мишеней внутри клеток и тканей. Этот вид окрашивания обычно используется для анализа субклеточных локализаций или специфических клеточных структур, например, экзосом [39].

Методы Показания к применению Преимущества и недостатки
Колориметрический, связанный с ферментомСтандартный световой микроскоп
  • Позволяет обнаружение 1 или 2-х мишеней с помощью стандартной световой микроскопии
  • Относительно дешевый
  • Широко доступен
  • Эпитопы могут быть повреждены во время фиксации
  • Может быть высокий фон
  • Ограничен в отношении обнаружения множества мишеней.
Флуоресцентный, связанный с ферментомФлуорисцентный/конфокальный микроскоп
  • Позволяет обнаружение множества мишеней и FRET (в зависимости от наличия флуоресцентного фильтра)
  • В целом доступная технология
  • Окрашенные образцы восприимчивы к необратимому фотообесцвечиванию, если они используются или хранятся ненадлежащим образом
Меченные золотомЭлектронная микроскопия
  • Разрешает обнаружение 1 или 2 мишеней при чрезвычайно высоком разрешении
  • Дорогой
  • Ограниченный в отношении обнаружения множественных мишеней.
Таблица 5. Методы иммуногистохимии и иммуноцитохимии.
Анализ проксимального лигирования (PLA)

Обнаружение и определение характеристик взаимодействия между двумя белками всегда затруднительно. Традиционные методы, такие как двухгибридный анализ, являются сложными и имеют некоторые ограничения. Анализ проксимального лигирования (PLA) является быстрым, чувствительным и легким в исполнении методом, который позволяет одновременное обнаружение и количественное определение белковых взаимодействий. Кроме того, будучи in situ методом, можно определить клеточную локализацию взаимодействия в адгезивных клеточных линиях и/или замороженных или парафиновых срезах тканей. PLA также позволяет обнаруживать и количественно оценить один эндогенный белок в естественных условиях. PLA был впервые описан в 2002 году Фредрикссоном и др. [40, 41]. С тех пор эта техника стала одним из наиболее широко используемых подходов для анализа взаимодействия нативных белков. Методология PLA основана на использовании двух антител, меченных олигонуклеотидами: эти антитела могут связывать два различных эпитопа одного и того же протеина или два различных протеина. Когда антитела находятся в непосредственной близости (около 20-40 нм друг от друга), например, когда два анализируемых белка взаимодействуют, олигонуклеотидные зонды на антителах будут гибридизоваться и связываться с двумя другими "коннекторными олигонуклеотидами", чтобы сформировать непрерывную структуру кольцевой ДНК. В этот момент ДНК-полимераза будет усиливать эту круговую структуру, которая остается ковалентно присоединенной к одному из PLA антител. Амплифицированная молекула ДНК может быть обнаружена с использованием стандартных флуоресцентных методов, таким образом, непосредственно указывает на взаимодействие между двумя анализируемыми белками. Методология PLA была использована для многих целей: один из наиболее часто используемых является подтверждение биомаркеров в клинических условиях [42-44]. PLA также использовали для изучения роли специфических белков в биологических процессах, таких как прогрессирование рака. В последнее время PLA была улучшена для непосредственного обнаружения посттрансляционных модификаций, таких как ацетилирование, фосфорилирование и т.д.

Применение антител  Рисунок 10
Рисунок 10. Схематическое изображение процедуры поверхностной маркировки клеток для магнит-опосредованной сортировки клеток и/или проточной цитометрии. Демонстрационные данные проточной цитометрии показывают MACS-сортированные CD8 + Т-клетки, которые пометили антителами против мембранных CD44 и CD107a.
Применение целых клеток in vitro и in vivo
Проточная цитометрия – анализ клеточной популяции

Одним из наиболее распространенных применений антител в медико-биологических исследований и клинических условиях является определение состояния различных клеточных популяций с помощью поверхностного маркировки и последующего анализа на проточном цитометре. Поверхностное окрашивание антителами, мечеными флуорохромом, может быть быстро выполнено на одноклеточных суспензиях; это окрашивание, как правило, весьма специфично и может быть детектировано с высокой чувствительностью. Кроме того, так как многие проточные цитометры могут обнаружить 3 или более флуорохрома одновременно, клетки могут быть помечены несколькими антителами, что позволяет идентифицировать отдельные популяции клеток, а также поверхностные белки, которые активируются после дифференцировки клеток, активации или апоптоза. Антитела должны быть выбраны тщательно, чтобы гарантировать, что эпитоп антигена-мишени экспрессируется на клеточной поверхности, и следует использовать блокирующий агент (например, общий Ig от вида хозяина антитела), чтобы избежать неспецифического связывания с рецепторами Fc, которые присутствуют на нескольких типах клеток, таких как различные субтипы лейкоцитов (рисунок 10).

Кроме того, иммуноокрашивание и проточная цитометрия могут быть использованы для обнаружения белков, которые находятся в ядре, цитоплазме и эндосомах, такие как факторы транскрипции и цитокины. В этом случае клетки должны быть фиксированы и пермебиализированы раствором формальдегида и мягким детергентом, таким как сапонин, который будет обратимо перфорировать клеточные мембраны. Иммуноокрашивание внутриклеточных белков должно быть выполнено в присутствии пермебилизирующего агента для того, чтобы облегчить попадание антитела в клетки. Поверхностное окрашивание должно быть выполнено до начала фиксации и пермеабилизирующего шага для того, чтобы избежать разрушения эпитопов поверхностных белков [45].

Агонистические антитела, специфичные к рецепторам клеточной поверхности, как правило, используется для активации иммунных клеток in vitro путем связывания и сшивания рецепторов, что приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей. Например, Т-клетки могут быть стимулированы in vitro комбинацией антител против CD3, который тесно связан с рецептором Т клеток (TCR) и должны быть активированы, чтобы облегчить передачу сигналов от TCR и CD28, который является костимуляторным рецептором. Тем не менее, второе антитело, специфическое для участка Fc первичного антител, должно быть использованыо, чтобы полностью сшить рецепторы и индуцировать детектируемую активацию клеток. В качестве альтернативы стимулирующее антитело может быть нанесено на планшет для культивирования перед добавлением клеток (Рисунки 6, 9) [46].

Антитела могут быть также использованы, чтобы блокировать рецепторы на поверхности клетки или нейтрализовать растворимые факторы in vitro. Например, в Т-хелперном skewing анализе Т-клетки культивируют в присутствии цитокинов, которые способствуют дифференциации в специфические популяции Т-хелперов, а также нейтрализующие антитела против цитокинов, которые могут противодействовать дифференцировке или способствовать дифференциации в направлении различных функциональных популяций [47].

В более ранней литературе из 1990-х годов авторы использовали термин "иммунофлуоресцентное окрашивание", чтобы описать проточную цитометрию.

Сортировка клеток и истощение

Флуоресцентно-опосредованная сортировка клеток (FACS) использует специфическое связывание антител, меченых флуорохромом, с клеткам для сортировки единичных клеток на основе заранее определенных флуоресцентных параметров. Этот метод очень быстрый и весьма специфичный. Тем не менее, требуется специализированное оборудование - проточная цитометрия. Антитела могут быть также использованы для разделения или сортировки клеток посредством связывания с магнитными шариками в процессе, известном как магнитно-опосредованная сортировка клеток (MACS). В MACS клетки помечены антителами с тагами, которые специфичны для конкретных поверхностных маркеров. Меченые клетки затем инкубируют с очень малыми магнитными шариками, которые связываются с тагами. Связанные с шариками клетки могут быть легко отделены от немеченых клеток путем применения сильного магнита (Рисунок 10) [48, 49].

In vivo применение

Антитела могут быть введены in vivo, чтобы истощить конкретные клеточные популяций для функционального анализа. Например, в иммунологических исследованиях специфические эффекторные субпопуляции лимфоцитов могут быть обеднены у мышей, чтобы определить последствия для иммунных реакций против специфических антигенов. Аналогичным образом антитела могут быть также использованы in vivo, чтобы нейтрализовать поверхностные рецепторы на клетках или связать растворимые факторы. Для этих применений антитела, как правило, производятся в больших количествах из гибридом, чтобы избежать реакции против ксеноантигенов, и очищаются для удаления реагентов клеточных культур и других потенциальных загрязнителей [50].

В заключение, антитела являются бесценным инструментом для биомедицинских исследований из-за их высокой чувствительности и специфичности, относительной простоты производства, а также гибкости в использовании. Установленные способы применения продолжают содействовать проведению исследований, а также новые разработки в области антител, как ожидается, и в дальнейшем будет расширять аналитические возможности научно-исследовательских лабораторий.

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия (МС) представляет собой аналитический метод, который измеряет отношение массы к заряду (м/г) ионов, чтобы детектировать, идентифицировать и количественного определить молекулы как в простых, так и сложных соединениях. В настоящее время MS является незаменимым инструментом для широкого круга областей применений, таких как протеомика, открытие новых лекарств, анализ окружающей среды, биомедицинские исследования. Анализ белков, в частности, претерпел очень быстрое развитие, так как использование MS инструментов всегда дает более точную и углубленную характеристику молекул. Тем не менее, MS имеет некоторые проблемы, которые необходимо еще решить: огромное количество генерируемых данных и наличие некоторых белков в изобилии, которые маскируют некоторые белки, представляющие интерес. Последняя проблема была частично преодолена с МС таргетным подходами, такими как множественный/выбранный мониторинг реакции (MRM/SRM). Другими словами, MS имеет некоторые проблемы с чувствительностью, в то время как производит высококачественные точные и конкретные данные. В этих рамках сочетание МС с методами на основе аффинности антител представляет собой стратегию, в которой молекула, представляющая интерес, в первую очередь получена с помощью иммуно-опосредованных подходов, а затем анализируется с помощью МС, увеличивая специфичность и чувствительность. Есть несколько количественных и качественных подходов, которые были разработаны путем объединения иммунологических и MS подходов. Наиболее часто используемые подходы кратко представлены ниже.

Стабильный Изотопный Стандарт и захват антипептидных антител

Методы MS позволяют абсолютное определение количества конкретного белка в сложном образце, таком как плазма. Это достигается за счет использования смесей синтетических пептидов с тяжелыми изотопами (Absolute QUAntification, AQUA). В 2004 году Андерсон и др. разработали Стабильный Изотопный Стандарт и захват антипептидных антител метод (SISCAPA), в котором пептиды, представляющие интерес, обогащаются с использованием анти-пептидных антител, иммобилизованных на наноколонке [51]. Протокол состоит из 4-х этапов: I) протеолиз образца белка трипсином; б) добавление тяжелых изотопов стандартные пептидов, такие как AQUA; III) иммунообогощение с использованием специфических анти-пептидных антител и IV) определение абсолютного количества пептида электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрией (ESI-MS). SISCAPA используется для нескольких применений, например, для количественного определения биомаркеров, например, сывороточного рецептора трансферрина (sTfR) у больных раком молочной железы [52]. Однако улучшение таргетных МС подходов были направлены на изучение иммуно-МС в комбинации с SISCAPA и MRM и создали так называемую иммуно-MRM.

Иммуно -MRM

Множественная реакция мониторинг масс-спектрометрия (MRM-МС) является таргетным количественным МС подходом с высокой специфичностью и точностью. Для того, чтобы увеличить чувствительность данного анализа, можно обогатить смесь пептидов, представляющих интерес, иммуноаффинностью, тем самым выполняя иммуно-MRM. Этот метод является воспроизводимым, может быть мультиплексирован и обеспечивает высокую чувствительность и специфичность. Основная проблема для широкого распространения использования иммуно-MRM является отсутствие апробированных антител, специфичных для этой техники. Антитела, как правило, производит для классического иммунологического анализа (например, ELISA, Вестерн-блоттинг), в то время как антитела для иммуно-MRM должны быть сформированы против коротких, линейных, протеотипических пептидов. В ряде исследований изучалось использование моноклональных антител в иммуно-MRM. Очевидно, что эти антитела предпочтительнее поликлональных. К сожалению, моноклональные антитела являются дорогими и их производство системами гибридом долго. В последнее время была продемонстрирована возможность создания иммуно-MRM моноклональных антител против триптические пептидных антигенов с помощью подхода клонирования рекомбинантных В клеток [53].

Иммуно-MALDI

Иммуно-MALDI (iMALDI) похож на SISCAPA подход: даже в этом случае пептиды захватываются с анти-пептидными антителами, но обогащенный образец затем наносят на конкретную мишень и анализируют с помощью матрично-лазерной десорбции ионизации (MALDI) МС. Этот метод был применен для диагностики различных патологий, таких как артериальная гипертензия [54]. Тем не менее, одним из главных ограничений iMALDI заключается в невозможности мультиплексировать анализ.

Масс-спектрометрический иммуноанализ

В масс-спектрометрическом иммуноанализе (MSIA), предложенном в 1995 [55], образец белка инкубируют с шариками, покрытыми специфическим антителом, а затем элюируют. Полученный образец можно анализировать непосредственно MALDI-TOF MS, следуя "сверху-вниз" подходу на весь белок [56]. Метод MSIA также может быть соединен с таргетным MS подходом, таким как SRM или MRM, путем трипсинового протеолиза элюированной пробы и последующим анализом MS. Такой подход может быть автоматизирован и мультиплексирован, как недавно сообщили Gauthier и соавт. [57, 58].

Благодарность

Dr. Valeria Severino правил текст и добавил обсуждение по PLA, RIP, CLIP, иммуно-PCR, SISCAPA, иммуно-MRM, iMALDI и MSIA в Марте 10, 2016.

Ссылки
  1. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 6th ed. Philadelphia: Saunders Elsevier.
  2. Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. Immunobiology: the immune system in health and disease. 6th ed. New York: Garland Science Publishing.
  3. Immunoprecipitation Protocol (For Analysis By Western Immunoblotting. Available from: www.cellsignal.com/support/protocols/IP_Western.html
  4. Biomarkers & Immunoassays. Available from: www.millipore.com/immunodetection/id3/elisaprotocols
  5. Optimized, High-Throughput Antibody Microarray of Pathogens. Available from: www.cfse.purdue.edu/media/annualmeeting/N4-1-Gehring.pdf
  6. Sano T, Smith C, Cantor C. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science. 1992;258:120-2 pubmed
  7. Malou N, Raoult D. Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies. Trends Microbiol. 2011;19:295-302 pubmed publisher
  8. Niemeyer C, Adler M, Wacker R. Detecting antigens by quantitative immuno-PCR. Nat Protoc. 2007;2:1918-30 pubmed
  9. Western blotting - a beginner’s guide. Available from: www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf
  10. Dot Blot. Available from: www4.vanderbilt.edu/vapr/dot_blot
  11. O'Neill R, Bhamidipati A, Bi X, Deb-Basu D, Cahill L, Ferrante J, et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:16153-8 pubmed
  12. Hughes A, Spelke D, Xu Z, Kang C, Schaffer D, Herr A. Single-cell western blotting. Nat Methods. 2014;11:749-55 pubmed publisher
  13. Carey M, Peterson C, Smale S. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harb Protoc. 2009;2009:pdb.prot5279 pubmed publisher
  14. Eberl H, Mann M, Vermeulen M. Quantitative proteomics for epigenetics. Chembiochem. 2011;12:224-34 pubmed publisher
  15. Guide to chromatin immunoprecipitation (ChIP) methods (Drs Graeme Cuthbert & Andy Bannister, University of Cambridge. Available from: www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=9
  16. O'Neill L, Turner B. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 2003;31:76-82 pubmed
  17. Landt S, Marinov G, Kundaje A, Kheradpour P, Pauli F, Batzoglou S, et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 2012;22:1813-31 pubmed publisher
  18. Ule J, Jensen K, Ruggiu M, Mele A, Ule A, Darnell R. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 2003;302:1212-5 pubmed
  19. Darnell R. HITS-CLIP: panoramic views of protein-RNA regulation in living cells. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2010;1:266-86 pubmed publisher
  20. Xue Y, Zhou Y, Wu T, Zhu T, Ji X, Kwon Y, et al. Genome-wide analysis of PTB-RNA interactions reveals a strategy used by the general splicing repressor to modulate exon inclusion or skipping. Mol Cell. 2009;36:996-1006 pubmed publisher
  21. Yeo G, Coufal N, Liang T, Peng G, Fu X, Gage F. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 2009;16:130-7 pubmed publisher
  22. Chi S, Zang J, Mele A, Darnell R. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 2009;460:479-86 pubmed publisher
  23. Hafner M, Landthaler M, Burger L, Khorshid M, Hausser J, Berninger P, et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 2010;141:129-41 pubmed publisher
  24. König J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M, Zupan B, et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 2010;17:909-15 pubmed publisher
  25. Selth L, Gilbert C, Svejstrup J. RNA Immunoprecipitation to Determine RNA-Protein Associations In Vivo. CSH Protoc. 2009;2009:pdb.prot5234 pubmed
  26. Keene J, Komisarow J, Friedersdorf M. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat Protoc. 2006;1:302-7 pubmed
  27. Hellman L, Fried M. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2007;2:1849-61 pubmed
  28. Holden N, Tacon C. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. J Pharmacol Toxicol Methods. 2011;63:7-14 pubmed publisher
  29. Egorina E, Sovershaev M, Østerud B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J Thromb Haemost. 2006;4:614-20 pubmed
  30. Smith P, Wiltshire M, Davies S, Patterson L, Hoy T. A novel cell permeant and far red-fluorescing DNA probe, DRAQ5, for blood cell discrimination by flow cytometry. J Immunol Methods. 1999;229:131-9 pubmed
  31. Smith P, Blunt N, Wiltshire M, Hoy T, Teesdale-Spittle P, Craven M, et al. Characteristics of a novel deep red/infrared fluorescent cell-permeant DNA probe, DRAQ5, in intact human cells analyzed by flow cytometry, confocal and multiphoton microscopy. Cytometry. 2000;40:280-91 pubmed
  32. Stradleigh T, Greenberg K, Partida G, Pham A, Ishida A. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. J Comp Neurol. 2015;523:545-64 pubmed publisher
  33. Appropriate Fixation of IHC/ICC Samples. Available from: www.rndsystems.com/ihc_detail_objectname_fixation_ihc_icc_samples.aspx
  34. Immunofluorescence Staining Protocol. Available from: www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm
  35. Vollert C, Moree W, Gregory S, Bark S, Eriksen J. Formaldehyde scavengers function as novel antigen retrieval agents. Sci Rep. 2015;5:17322 pubmed publisher
  36. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006;0:Unit 3.22 pubmed publisher
  37. Beckmann C, Sharf B, Barzansky B, Spellacy W. Student response to gynecologic teaching associates. Am J Obstet Gynecol. 1986;155:301-6 pubmed
  38. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir S, et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 2002;20:473-7 pubmed
  39. Zieba A, Pardali K, Söderberg O, Lindbom L, Nyström E, Moustakas A, et al. Intercellular variation in signaling through the TGF-β pathway and its relation to cell density and cell cycle phase. Mol Cell Proteomics. 2012;11:M111.013482 pubmed publisher
  40. Spears M, Taylor K, Munro A, Cunningham C, Mallon E, Twelves C, et al. In situ detection of HER2:HER2 and HER2:HER3 protein-protein interactions demonstrates prognostic significance in early breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2012;132:463-70 pubmed publisher
  41. Pinto R, Carvalho A, Conze T, Magalhaes A, Picco G, Burchell J, et al. Identification of new cancer biomarkers based on aberrant mucin glycoforms by in situ proximity ligation. J Cell Mol Med. 2012;16:1474-84 pubmed publisher
  42. Staining Intracellular Antigens for Flow Cytometry. Available from: www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/staining-intracellular-antigens-for-flow-cytometry.pdf
  43. Proliferative Assays for T Cell Function. Available from: www.penningerlab.com/uploads/media/T_cell_proliferation_01.pdf
  44. Fast, Easy and Column-Free Cell Isolation. Available from: www.stemcell.com/en/Products/Popular-Product-Lines/EasySep.aspx
  45. Seaman W, Wofsy D. Selective manipulation of the immune response in vivo by monoclonal antibodies. Annu Rev Med. 1988;39:231-41 pubmed
  46. Anderson N, Anderson N, Haines L, Hardie D, Olafson R, Pearson T. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 2004;3:235-44 pubmed
  47. Xu Q, Zhu M, Yang T, Xu F, Liu Y, Chen Y. Quantitative assessment of human serum transferrin receptor in breast cancer patients pre- and post-chemotherapy using peptide immunoaffinity enrichment coupled with targeted proteomics. Clin Chim Acta. 2015;448:118-23 pubmed publisher
  48. Schoenherr R, Saul R, Whiteaker J, Yan P, Whiteley G, Paulovich A. Anti-peptide monoclonal antibodies generated for immuno-multiple reaction monitoring-mass spectrometry assays have a high probability of supporting Western blot and ELISA. Mol Cell Proteomics. 2015;14:382-98 pubmed publisher
  49. Mason D, Reid J, Camenzind A, Holmes D, Borchers C. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 2012;56:213-22 pubmed publisher
  50. Nelson R, Krone J, Bieber A, Williams P. Mass spectrometric immunoassay. Anal Chem. 1995;67:1153-8 pubmed
  51. Kelleher N, Thomas P, Ntai I, Compton P, LeDuc R. Deep and quantitative top-down proteomics in clinical and translational research. Expert Rev Proteomics. 2014;11:649-51 pubmed publisher
  52. Ranney B, Leonardson G. Volume reduction of the uterus during and soon after hysterectomy. Am J Obstet Gynecol. 1986;155:354-7 pubmed
  53. Gauthier M, Pérusse J, Awan Z, Bouchard A, Tessier S, Champagne J, et al. A semi-automated mass spectrometric immunoassay coupled to selected reaction monitoring (MSIA-SRM) reveals novel relationships between circulating PCSK9 and metabolic phenotypes in patient cohorts. Methods. 2015;81:66-73 pubmed publisher
ISSN : 2329-5139